在线固相萃取UHPLC-MS/MS法测定水中15种抗生素

2022-08-10苏宇亮胡克武郝怡菲袁汉鸿

净水技术 2022年8期

吴斌，苏宇亮，胡克武，郝怡菲，袁汉鸿，吴杰

(珠海水务环境控股集团有限公司，广东珠海 519020)

近年来，抗生素在水源水中的频繁检出及其对饮用水生物安全的潜在风险备受关注。抗生素(antibiotics)指由细菌、霉菌或其他微生物在生活过程中所产生，具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能干扰或抑制致病微生物的生存，广泛地应用于人类及动物的疾病防治、农业生产、畜牧及水产养殖等领域。抗生素的大量使用必然会导致过多的残留物进入到环境中，目前抗生素产生的环境危害愈发突出。因此，抗生素的生态环境效应日益受到广大环境领域学者的关注[1-2]。研究指出，中国地表水环境中能检测到6类共68种抗生素[3]。很多国家和地区如美国、法国、日本[4-6]，以及国内的珠江水系、北京的清河水等都有抗生素检出[7-8]。

抗生素污染对饮用水水源安全造成了严重的威胁，在饮用水处理工艺中对抗生素的去除研究越来越受关注。张静等[9]从水厂常规处理工艺、深度处理工艺两部分介绍近几年国内外水厂处理含抗生素原水的方法及效果，此外，还从活性炭池中微生物的抗药性与耐氯性、消毒副产物以及给水管网3方面来论述处理含抗生素水体对给水厂的影响。结果表明，在传统工艺中，混凝沉淀是去除抗生素的主要工艺，对喹诺酮类、磺胺类、四环素类抗生素去除率可达到50%～60%，且可通过调节混凝剂投加量、添加助凝剂PAM等方式增强混凝效果；紫外与氯消毒联合使用时对易光解抗生素的去除效率可达到30%～50%。臭氧氧化和活性炭池等深度处理工艺亦会促进抗生素的去除，但受臭氧投加量、接触时间等因素影响显著，且抗生素会增强炭滤池和管网中微生物的抗药性及耐氯性；在采用NaClO作为消毒剂时可能会促进毒性较高的氯代/溴代消毒副产物生成。此外，残留抗生素会消耗管网中的余氯，还会促进机会病原体的出现，增加饮用水安全风险[9]。张国芳[10]对比分析了新型处理技术对抗性基因的去除现状，研究总结出超滤膜技术对病原体的去除率高达90%～100%，多用于取代传统的去除工艺，缺点是不能完全去除游离的抗生素抗性基因(ARGs)，且膜结垢和更换需要的成本较高。光(UV、日光)催化技术对抗生素抗性菌(ARB)和ARGs在较短时间内的去除效率也较高，可降低ARB的抗生素耐受性，缺点是会引入新的污染物，如较难去除的纳米材料等。联合技术可有效灭活ARB和去除ARGs，可完全去除ARGs，有效控制水平基因转移风险，缺点是需较高的消毒剂投加量，UV灯管的更换带来高额成本。

抗生素滥用会带来极大的危害[11]，且水中目标化合物浓度通常为痕量级，因此，迫切要求开发一种快速准确的抗生素检测技术来监测环境水中的抗生素含量。水中抗生素的传统检测方式是微生物法[12]，而目前测定抗生素常用的方法主要有液相色谱法[13]和液相色谱-串联质谱法[14-15]。液相色谱法测定易受杂质干扰，灵敏度低；而液相色谱-串联质谱法具有高效分离、灵敏度高、检测快速、定性与定量检测于一体等优点，已成为近年来痕量残留检测技术的主流方向。由于抗生素在地表水中的含量为痕量级别，富集方法也尤为重要，但是一般文献中水样富集使用的固相萃取技术操作比较复杂，需要使用独立的固相萃取仪，萃取后再转移至液相色谱-串联质谱仪检测[16-17]，这种固相萃取具有耗时长、操作复杂、溶剂浪费等缺点。本研究使用在线固相萃取技术，自动进样器取5 mL水样在线固相萃取、净化、洗脱后直接进入液相色谱-串联质谱仪检测，无需二次转移，具有操作简便、回收率高、分析时间短、节约溶剂的优点。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

甲醇：色谱纯；乙腈：色谱纯；甲酸：质谱纯；脱溶剂气：高纯氮(99.999%)；碰撞气：高纯氩(99.999%)。

抗生素标准品：6类15种抗生素标准样购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度要求大于97%。分别为磺胺类(磺胺甲恶唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪)、大环内酯类(红霉素、罗红霉素)、四环素类(四环素、金霉素、土霉素、强力霉素)、β-内酰胺类(青霉素 G)、喹诺酮类(氧氟沙星、恩诺沙星)、氯霉素类(氯霉素)。

1.1.2 仪器

液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(Waters公司Xevo TQ-S Micro)。离子源：电喷雾离子源(ESI)；色谱柱：ACQUITY HSS T3柱，2.1 mm×50 mm，颗粒粒径为1.8 μm；针式过滤器：聚偏氟乙烯(PVDF)，孔径为0.22 μm。

1.2 液相色谱条件

色谱流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈/甲醇=90/10；柱温为35 ℃；进样体积为5 mL。色谱流动相梯度设置如表1所示。

表1 色谱流动相梯度设置Tab.1 Gradient Setting for Chromatographic Flow Phase

1.3 质谱条件

电离源：电喷雾正离子模式；毛细管电压：1.5 kV；源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：550 ℃；脱溶剂气流量：1 000 L/h。采用质谱多重反应监测模式(MRM)，质谱质量条件参数如表2所示。

表2 抗生素的质谱参数Tab.2 Mass Spectrum Parameters for Antibiotics

1.4 标准系列的配制

标准储备溶液：分别称取每种待测组分标准品约0.010 0 g(精确至0.000 1 g)，用甲醇溶液定容至10 mL棕色容量瓶中，此标准溶液质量浓度为1 000 μg/mL，置于-18 ℃冰箱避光保存。分别吸取15种抗生素的标准储备液100 μL，用甲醇定容至100 mL容量瓶，配制成质量浓度为1 μg/mL的混合标准储备液。吸取1 μg/mL的混合标准储备液100 μL，用甲醇定容至10 mL容量瓶，配制成质量浓度为10 μg/L的混合标准工作液，在4 ℃冰箱中保存。

分别取10 μg/L的混合标准工作液25、50、100、250、500、1 000 μL，加纯水20 mL后加甲酸50 μL调节pH，再用纯水定容到50 mL的容量瓶，得到15种抗生素质量浓度为5、10、20、50、100、200 ng/L的标准系列。

1.5 样品处理

1.5.1 样品采集

用清洗干净并干燥的棕色玻璃瓶或聚四氟乙烯(全氟丙烯)瓶采集水样。采集时应注满容器，上部不留空间。样品在4 ℃避光冷藏保存，12 h内测定。

1.5.2 样品前处理

用玻璃注射器抽取水样，经PVDF滤膜过滤，用甲酸调节pH值为2～3。

1.5.3 在线固相萃取

利用在线固相萃取HLB小柱富集前处理后的样品，在线固相萃取流动相A为2% NH4OH溶液；流动相B为0.5%甲酸溶液；流动相C为乙腈/甲醇=90/10；流动相D为甲醇/乙腈/丙酮=1/1/1。在线固相萃取流动相梯度设置如表3所示。

表3 在线固相萃取流动相梯度设置Tab.3 Gradient Setting for Online Solid-Phase Extraction Flow Phase

2 结果与讨论

2.1 样品测定及结果

将预处理后的样品采用在线固相萃取，进样量为5 mL，按照仪器分析条件进行测定，质谱多反应监测(MRM)模式采集。进样质量浓度为50 ng/L时的色谱图检测结果图1所示。

图1 15种抗生素(50 ng/L)100%归一化色谱图Fig.1 100% Normalized Standard Ion Chromatogram of 15 Antibiotics (50 ng/L)

2.2 标准曲线和检测限

取6个20 mL进样瓶分别取1.4小节中的标准系列，然后在线固相萃取后进样测定，以色谱峰面积进行定量，得到该检测方法的线性回归方程、相关系数及检测限(以3倍信噪比计算)等参数(表4)。

表4 检测标准曲线和检测限Tab.4 Detection Standard Curve and Detection Limit

2.3 精密度、实际水样和水样加标回收率的检测

以某地区出厂水、管网水、地表水为实际水样，50 ng/L的抗生素混标进行加标回收分析，测定该方法的精密度和加标回收率(重复7次)，结果如表5所示。

表5 实际水样加标回收率和相对标准偏差(n=7)Tab.5 Recovery Rate and Relative Standard Deviation of Real Samples (n=7)

2.4 实际水样检测

对某地区的出厂水、管网水、地表水进行检测。饮用水中检出金霉素、磺胺二甲嘧啶、强力霉素、四环素，质量浓度为0.94～2.49 ng/L，对人群健康基本没有风险；地表水中检测出磺胺类(磺胺甲恶唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪)、四环素类(强力霉素、四环素、土霉素、金霉素)及红霉素，质量浓度为2～27 ng/L，其中河水中检测抗生素的情况显著多于水库。