胞外体在脓毒症中脏器功能保护机制的研究进展

李群超，沙玉霞，周浩泉

(安徽医科大学附属省立医院儿科，合肥230001)

脓毒症是由感染引起的一种全身炎症反应综合征，多继发于严重的烧伤、创伤、慢性疾病、危重病继发院内感染等，严重时可发展为脓毒性休克，甚至多器官功能衰竭[1]。一项针对全国44所医院重症监护病房的横断面调查报告显示，重症监护病房中脓毒症的发病率为20.6%，90 d病死率为35.5%[2]。一项调查分析显示，影响急诊医师诊治脓毒症的最主要原因是早期识别能力有限(34.0%)，其次是治疗费用过高(14.7%)[3]。由此可见，脓毒症早期诊断与降低治疗费用对脓毒症患者的治疗极其重要。研究发现，胞外体不仅能调节脓毒症患者机体炎症免疫反应、保护其器官功能，还可作为脓毒症诊断和治疗的潜在靶点[4]。张国虎等[5]实验发现，人胎盘间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)来源的胞外体可通过微RNA(microRNA，miRNA/miR)-126抑制大鼠微血管内皮细胞中高迁移率族蛋白B1的水平而降低炎症反应并保护受损的器官功能，从而明显提高小鼠存活率。与此同时，胞外体不仅可以参与机体的免疫应答、抗原呈递，修复受损组织，还具有毒性较小、免疫反应少、循环中相对稳定等优点[6]，在脓毒症的诊治中起重要作用，有望为脓毒症的治疗提供新的策略。

1 胞外体

胞外体是一种直径为40～100 nm的脂质双层盘状囊泡，作为特异性细胞外载体，能够在细胞间传递 miRNA、蛋白质、脂类等物质，发挥细胞间通信作用，调节靶细胞生物学功能[7]。胞外体来源广泛，几乎人体所有类型的细胞均能够分泌，如巨噬细胞、血小板、平滑肌细胞；血液、唾液、支气管肺泡灌洗液、尿液等体液中亦可检出，且易于检测[8]。同时，由于胞外体组织来源不同，不同病理、生理状态下会分泌具有特异性的分子标志物，在疾病的早期诊断和治疗方面具有巨大的潜能[9-10]，如脓毒症、心血管疾病、癌症等疾病的早期诊疗。此外，胞外体还具有靶向性、特异性、稳定性、低毒性和低免疫原性等生物学特性[11]，且能穿越血脑屏障等主要生理屏障，可作为药物传递载体。

胞外体的产生机制尚不完全清楚，内吞体分选转运复合体途径是其最经典途径：首先细胞质膜向内凹陷形成早期胞内体，随后在内吞体分选转运复合体及多种辅助蛋白的调控下，细胞质中的信使RNA、miRNA、蛋白质及脂质等物质包裹形成多泡胞内体，最后通过胞吐作用释放到细胞外[12-13]。胞外体表面生物膜与细胞膜结构和组成极为相似，具有高度的生物稳定性，同时膜表面也具有许多特征分子，如四跨膜家族蛋白(CD9、CD35、CD63、CD81、CD82)、热激蛋白(heat shock protein,HSP)家族(如HSP70、HSPA5、HSP90)、抑癌基因101等[14]。可根据胞外体大小、形态、浓度、蛋白质组成等特性，采用超速离心法、聚合沉淀法、蛋白质印迹法、流式细胞仪等方法对其进行分离提纯及鉴定[15-16]。

2 胞外体参与脓毒症的炎症调控和免疫调节

从初始感染到进展为脓毒症是一个复杂的病理生理过程，早期研究认为过度炎症反应引发持续放大的全身炎症反应综合征是导致脓毒症病死的主要原因。但研究发现，在脓毒症发生发展过程中会出现成熟粒细胞减少以及成熟比例下降、淋巴细胞和树突状细胞减少等现象[17]，提示其固有免疫和特异性免疫均受到抑制，表明脓毒症是炎症反应与免疫抑制共同作用的结果[18]。因此，及时发现并合理调控炎症与免疫反应，对脓毒症的预防与治疗均有重要意义。

2.1脓毒症的炎症调控 脓毒症机体炎症反应失控是机体代偿与失代偿的动态过程，并且是非线性演变的过程，可进一步导致机体稳态失调。胞外体可以介导细胞间通信，在脓毒症炎症反应和免疫监测等方面起重要作用。Reithmair等[19]通过高通量测序技术和实时荧光定量聚合酶链反应对脓毒症患者miRNA谱进行表征分析，发现健康志愿者与脓毒症患者胞外体miR-21-5p、miR-193a-5p、miR-199b-5p等表达水平比较差异有统计学意义，且miR-199b-5p可作为脓毒症与脓毒症休克患者的潜在监测指标，对脓毒症的诊断和生存预测具有重要意义。胞外体炎症调控也取决于患者机体炎症介质水平。当机体炎症反应较强时，可表现出抑制免疫的特性。在盲肠结扎和穿刺脓毒症模型中，脂肪源性MSC来源的胞外体可通过调节炎症氧化信号轴抑制大鼠全身免疫炎症反应，有效地降低循环、脑脊液中炎症介质水平，保护脑组织免受脓毒症损伤[20]。同时，也有研究发现，诱导MSC来源的胞外体miR-27b过表达可以抑制组蛋白去甲基化酶含Jumonji结构域蛋白3和核因子κB在基因启动子区的募集来减少肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6等炎症介质的表达，并增加抗炎因子IL-10的表达，提高脓毒症小鼠的存活率[21]。

2.2脓毒症的免疫调节 巨噬细胞是先天性免疫系统的重要组成，对脓毒症患者的免疫监测与免疫调节至关重要，其中M1型巨噬细胞可促进炎症反应，而M2型巨噬细胞可调节免疫抑制修复。Juan等[22]发现在脓毒症诱导的急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)中M2型巨噬细胞来源的胞外体miR-93-5过表达，可降低IL-1β、IL-18和细胞焦亡相关蛋白的表达，从而发挥保护肾组织的作用；而M1型巨噬细胞则相反。在脓毒症初始阶段，巨噬细胞表型以M1型为主，随着疾病的进展，巨噬细胞表型逐渐向M2型转化[22]，可调节机体免疫抑制。但由于脓毒症幸存者存在长期显著的免疫抑制，巨噬细胞功能严重受损，导致机体自身调节效果较差。Zhao等[23]研究发现，在心肌缺血再灌注小鼠模型中，MSC衍生的胞外体miR-182可通过抑制Toll样受体4/核因子κB信号通路调节巨噬细胞向M2型极化，减轻炎症级联反应，改善小鼠心肌缺血再灌注损伤，而敲除miR-182则对小鼠心脏保护作用欠佳。Song等[24]使用IL-1β处理人脐带来源的MSC胞外体介导miR-146a转移至巨噬细胞，诱导巨噬细胞向M2型极化，可有效改善脓毒症小鼠的症状。以上研究提示胞外体可以通过诱导巨噬细胞向M2型极化来调节机体免疫，减轻脓毒症患者炎症反应，以保护受损的组织和器官，改善预后。这为提高脓毒症患者自身免疫力提供了新的方向，为脓毒症治疗应用提供了新的依据。

获得性免疫系统对脓毒症的发生发展也起着关键作用。在脓毒症早期大量炎症介质释放，机体炎症过度反应，甚至引发弥散性血管内凝血；而后期淋巴细胞大量凋亡、耗竭，又使机体进入免疫抑制状态，脓毒症患者脾脏中的记忆性T细胞CD4+和CD8+数量显著减少[25-26]。Gao等[27]发现脓毒症小鼠中富含细胞因子/趋化因子的胞外体通过诱导Th1/Th2细胞的分化，可增强T淋巴细胞的增殖与迁移，抑制炎症反应，延长盲肠结扎和穿刺小鼠的生存时间。

综上，胞外体可通过调节炎症介质比例、巨噬细胞极化、淋巴细胞增殖分化，参与机体的炎症调控和免疫调节。此外，胞外体还具有稳定、安全、易保存、可人为调节其内容物等优点，在调节脓毒症患者的炎症与免疫失衡方面具有巨大的潜力，可用于改善患者的免疫功能。

3 胞外体对脓毒症器官功能的保护作用

脓毒症发生发展，最终至多器官功能衰竭是一个连续的过程，是炎症介质大量释放、凝血系统激活和血管内皮细胞损伤相互作用的结果。因此，准确评估感染严重程度、及时发现并控制炎症风暴、进行呼吸循环支持、尽早修复受损组织器官是有效避免多器官功能障碍综合征等严重并发症产生的核心。胞外体在受损的组织可发挥多种生物学功能，参与靶细胞调控，促进细胞增殖、血管与组织修复，可以有效减轻器官功能损害。

3.1肺 脓毒症患者通常会出现急性肺损伤(acutelunginjury,ALI)或急性呼吸窘迫综合征等肺部并发症，表现为肺泡巨噬细胞激活、细胞因子过量释放、炎症细胞浸润，导致肺内炎症反应失控。肺泡上皮细胞作为脓毒症患者肺泡防御的第一道防线，在肺损伤过程中不仅最先被破坏，还是肺部疾病进展的驱动因子。研究发现，肺泡上皮来源的胞外体可促进肺泡巨噬细胞活化，加重脓毒症患者肺损伤[28]。

提高紧密连接蛋白稳定性与减轻局部炎症介质释放可保护肺泡上皮细胞，从而达到减轻肺功能损伤、改善预后的目的。研究发现，内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)可通过清除细菌、减少炎症反应、减轻血管渗漏等方式降低脓毒症引起的肺损伤，是一种有前景的治疗策略[29]。但EPC不易大量获得且具有潜在风险，难以直接应用于临床。Tang等[30]研究发现，在脂多糖诱导小鼠ALI模型中miR-126-5p可以增加紧密连接蛋白的表达，降低小鼠肺损伤严重程度。Wu等[31]研究发现，EPC分泌的胞外体miR-126可促进肺内皮细胞的增殖、迁移，改善ALI。也有研究发现，miR-126-3p和miR-126-5p在EPC胞外体中大量表达并分别抑制了脂多糖诱导的高迁移率族蛋白B1和血管细胞黏附分子-1的水平，降低了小鼠炎症反应[32]；而EPC胞外体中缺失miR-126则不能改善脓毒症患者的生存率。以上研究表明，EPC来源的胞外体具有保护脓毒症患者器官功能的作用，提示miR-126可能是一种减轻肺损伤的潜在机制。因此，诱导EPC来源的胞外体并传递miR-126可以减轻肺组织炎症反应，预防微血管功能障碍，可能为脓毒症患者的治疗开辟新途径。但仍需要进一步研究EPC来源的胞外体作用机制，以使其真正成为ALI/急性呼吸窘迫综合征临床治疗的新策略。

3.2心脏 心脏功能受损是脓毒症患者不良预后的重要原因，主要表现为心肌功能障碍、收缩力下降、心肌顺应性损伤[33]。Xu等[34]将脂多糖诱导MSC衍生的胞外体作用于小鼠心肌梗死模型，发现其可通过抑制核因子κB信号通路并部分激活蛋白激酶B(proteinkinase,PKB/Akt)1/Akt2信号通路减轻心肌梗死后的炎症反应与细胞凋亡。心肌缺血再灌注小鼠模型中MSC衍生的胞外体miR-182通过抑制Toll样受体4/核因子κB信号通路并调节巨噬细胞向M2型极化，减小梗死面积[23]，提示胞外体miR-182在MSC的脓毒症心脏保护中起着重要作用。也有研究发现，心肌缺血再灌注大鼠模型中MSC来源胞外体可减轻心肌氧化应激反应和心肌细胞损伤[35]。以上研究提示，MSC来源的胞外体在心肌修复中有重要作用，为减轻脓毒症的心功能损伤提供了新思路。

胞外体是一种很有前景的药物递送载体，但单核吞噬系统对胞外体的快速摄取，会使其积累于肝脏和脾脏，限制其在心脏等靶器官的分布。预先阻断胞外体的摄取，然后传递治疗性胞外体，可以有效地改善治疗药物在目标靶器官的分布，是一种很有前途的基因治疗方法。在阿奇霉素诱导的心脏毒性模型，Wan等[36]预先注射胞外体阻断剂阻断单核吞噬系统对胞外体的摄取，显著提高了胞外体的治疗效果。然而，有些胞外体可通过增加氧化酶活性，损伤线粒结构与功能，引发心脏能量代谢障碍，参与心肌功能的损伤。鞘磷脂酶抑制剂GW4869是胞外体产生和释放的抑制剂，Essandoh等[37]研究发现，GW4869治疗可显著抑制RAW264.7巨噬细胞的胞外体和炎症介质(肿瘤坏死因子-α、IL-1β、IL-6)的释放，从而改善心脏功能。因此，进一步研究不同来源的胞外体对心脏的作用机制，阐明其对脓毒症患者心脏功能的影响，将会极大改善脓毒症患者的预后，提高其生命质量。

3.3肾脏 AKI主要是由脓毒症及脓毒性休克所致，是脓毒症的一种潜在且致命的并发症。AKI的发病率、病死率均较高，且缺乏有效的治疗方法。因此，及时发现AKI并给予安全有效的支持治疗对改善脓毒症患者肾损伤预后尤为必要。

MSC(如骨髓、脐带和脂肪来源的MSC)在治疗AKI中显示了良好的疗效，其分泌的胞外体也受到高度重视。Pan等[38]发现胞外体通过上调miR-21并将其整合到肾小管上皮细胞中，然后靶向下游的程序性细胞死亡因子4/核因子κB和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/Akt通路，可发挥抗炎和抗凋亡作用，减少脓毒症小鼠炎症介质的系统性积累，使其免于多器官功能障碍。Fu等[39]实验发现，在盲肠结扎和穿刺脓毒症模型中miR-21可通过人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt信号通路降低炎症介质水平，减少肾细胞凋亡，减轻脓毒症小鼠的肾损伤。脐带MSC胞外体通过上调miR-146b水平抑制核因子κB活性，也可显著降低血肌酐和尿素氮水平，提高盲肠结扎和穿刺小鼠的存活率[40]；骨髓MSC胞外体可向肾组织传递miR-199a-3p，保护肾小管上皮细胞免受损伤[41]；脂肪源性MSC胞外体可减轻AKI模型肾脏炎症和微循环紊乱状态[42]。由此可见，MSC来源的胞外体通过作用于受损的肾脏组织，参与靶细胞调控，减轻肾功能损害，为脓毒症肾损伤的治疗提供了新思路。

4 小 结

胞外体因独特的生物学特性及治疗潜力而备受关注，许多研究探索了胞外体与脓毒症之间的联系。胞外体在脓毒症的炎症调控、免疫调节和器官功能保护方面起积极的作用。胞外体参与调控脓毒症发生发展的各个病理生理过程，发挥调节功能的同时也可能具有两面性，如不同来源的胞外体可能产生相反的作用；同时同种来源的胞外体多靶点调控脓毒症的过程中也可能会产生负面作用。此外，由于胞外体膜的稳定性，能保护其内物质不被分解，可以作为药物载体进行靶向治疗，但分离纯化工艺复杂，载药量低，无法规模量产。总之，胞外体在脓毒症早期预防、治疗与监测等方面有广阔的应用前景。