骨组织工程学中复合支架及其应用研究进展

彭鑫，彭中华，谭奇超，庞河，谭荣雄，蔡杰钦，吴晓慧，魏波，李文庆

(1.广东医科大学，广东 湛江 524000； 2.茂名市人民医院超声科，广东 茂名 525000；3.深圳市南山区人民医院手足外科，广东 深圳 518000)

骨不愈合是骨损伤修复的难点，导致骨不愈合的因素主要包括慢性感染性疾病(如结核)、恶性侵袭性疾病(如骨肿瘤)、骨折合并软组织破坏(如大面积开放性骨折)以及患者自身因素(如老年人或免疫功能低下)等[1]。植骨是骨折延迟愈合、不愈合的有效治疗手段之一，主要包括患者自体骨移植(如作为皮质骨移植物的髂骨移植、带有血运的腓骨移植)、同种异体骨移植(如脱钙骨基质)和骨替代品移植(如磷酸钙水泥、陶瓷及其复合物、骨诱导生长因子、生物活性复合材料)等。其中，作为“金标准”的自体骨移植具有取骨部位疼痛、增加感染概率、来源有限等缺点，而同种异体骨移植具有免疫反应和疾病传播的潜在风险[2]。因此，骨组织工程学作为潜在替代方法已成为骨重建的主要策略。生物材料支架是骨组织工程学的核心，目前3D打印已成为制备生物支架的流行技术[3]。通过3D打印技术可打印具有生物兼容性且符合患者特定病灶形态的复合支架，不仅在形状上与缺损骨接近，还可模拟与骨组织相似的孔状结构和力学特性。现就骨组织工程学中复合支架及其应用研究进展予以综述。

1 复合支架的要求

研究者普遍认为，支架可作为临时的机械结构用以模仿骨骼组织中的细胞外基质[4]，从而加速骨的再生修复过程。在骨的移植修复中，常将聚合物和陶瓷作为复合支架的材料组成。天然骨组织是由羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)和胶原纤维基质组成的复合物，在组织工程应用中最常见的复合材料是结合了高分子材料与陶瓷材料的复合材料，如聚合物/陶瓷复合支架，聚合物可提供良好的弹性强度和抗弯曲性，陶瓷则提供支架的压缩强度、降解率和成骨能力[5]。因此，陶瓷和生物玻璃矿物被添加到天然和合成聚合物中，如磷酸三钙(tricalcium phosphatec，TCP)/磷酸四钙聚合物、β-TCP/生物玻璃、HA/明胶、HA/淀粉、聚己内酯(poly caprolactone，PCL)/HA等[6]。一个好的支架需要具备的属性主要包括：①具有良好的表面渗透性，可转移生物的相关信号成分，同时还应具有一定的机械力学强度，且最好与天然骨组织相近[7]；②具有合适的孔径和表面粗糙度，以促进相关细胞附着或诱导其向成骨方向分化[8]；③具有良好的生物相容性，可最大限度地降低局部毒性和不良免疫/炎症反应的风险[9-10]。

2 复合支架的材料

2.1天然聚合物 多糖、蛋白质、淀粉、藻酸盐、透明质酸等均具有天然的生物相容性，且与陶瓷相比质地较软，可适应所需形状的要求；此外，天然聚合物还包含特定的分子结构域，是细胞发育不同阶段发送重要信号的区域，可在细胞发育的各阶段支持和引导细胞分泌更多相关的细胞外基质[11]，从而增强支架与组织的生物相互作用。Maciel等[12]用壳聚糖与壳聚糖/纤维蛋白原共聚物分别干预人巨噬细胞，结果发现用壳聚糖/纤维蛋白原共聚物干预的巨噬细胞产生了大量重要因子和血管生成介质，如骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-7、成纤维细胞生长因子-7和血小板衍生生长因子-BB等，而这些因子均与骨骼和伤口愈合有关，由此认为，壳聚糖/纤维蛋白原共聚物可调节巨噬细胞对骨重塑及骨再生的反应。同时，纤维蛋白还是创面愈合的重要基本成分，具有较强的血管再生性能，是骨再生的重要组成部分[12-13]。Cuadros等[14]制备了海藻酸钙/明胶多孔支架，该支架除了可改善间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的黏附和增殖，还可影响MSC分化为成骨细胞和成软骨细胞谱系的过程。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，具有良好的生物相容性，可用于骨和软骨支架，而天然聚合物的不足之处在于其可导致严重的免疫排斥反应或自身携带微生物、病毒等造成感染风险，同时其稳定性较低还会导致降解和分解代谢率较高[15]。

2.2合成聚合物 合成聚合物主要包括聚酯类(如聚乳酸、聚乙醇酸、PCL)和聚乳酸-乙醇酸(polylactic acid-glycolic acid，PLGA)等。合成聚合物合成简单、成本低，且制造工艺可由实验室制造扩大至工业规模以满足潜在临床需求，同时部分商业化合成聚合物的物理、化学和机械性能也与天然组织相似[16]。聚乳酸除了具备良好的力学性能和热稳定性外，还具有生物相容性[10]。Teixeira等[17]制作了涂有Ⅰ型胶原蛋白和聚多巴胺的聚乳酸支架，并研究猪骨髓干细胞对其的反应，结果发现聚多巴胺+Ⅰ型胶原蛋白在前14 d可促进猪骨髓干细胞细胞外基质沉积，在21 d时，猪骨髓干细胞中的碱性磷酸酶表达水平显著升高，表明聚多巴胺和Ⅰ型胶原蛋白涂层可增强3D打印的聚乳酸支架的骨诱导性。合成聚合物的缺陷主要在于合成聚合物均是疏水的，可导致生物活性降低[18]。Shafiee等[19]选择聚乙烯醇和PCL制作支架用于兔模型体内研究，结果发现模型兔的病灶缺损愈合良好。

2.3金属材料 钛合金、钴基合金、镁合金等金属材料作为优秀候选材料的主要特性是对活细胞良好的生物相容性，这在很大程度上决定了植入物能否成功与骨宿主相结合[20-21]。与其他金属植入物相比，多孔镁和镁合金的机械性能更接近天然骨[22]。此外，Lino等[23]研究发现，锶的二价阳离子可替代HA中的钙，在骨骼形成过程中起诱导合成代谢和抗分解代谢的作用；该研究中制作的含1%锶的PCL-富马酸二异丙酯支架可促进骨组织再生，且未引起局部炎症反应，同时血清锶水平未升高还可避免引发心血管反应。Rentsch等[24]将三价铬掺入透钙磷石形成的磷酸钙骨水泥并植入大鼠的骨缺损，结果发现新骨组织的形成显著增加，并可以浓度依赖的方式显著改善骨吸收和新骨形成，表明加入三价铬是一种增强磷酸钙骨水泥细胞相容性的创新方法。金属材料的缺点在于其不能随着时间的推移而腐蚀，且释放的金属离子可导致感染及其他健康问题等[25]。

2.4无机材料 磷酸钙、陶瓷、生物活性玻璃或其组合是目前最常用的合成骨替代物，该类骨替代物具有合适的刚度、优异的骨传导性和骨诱导性以及耐化学腐蚀特性，可促进生物矿化[26]。如Oliveira等[27]将高互通性大孔HA支架接种于大鼠骨髓基质细胞，结果显示细胞黏附与增殖情况均较好，且具有一定活力。此外，多种无机材料也可组合成复合无机材料，如HA/TCP。而生物材料另一重点研究领域是β-TCP，常见的组合方式是不同比例的较稳定部分HA与易溶部分β-TCP组合，其中HA具有良好的机械性能，β-TCP除了具有骨传导性，还有骨诱导性及安全性，这种组合可提高材料本身的生物活性和生物降解率，在保证生物材料稳定性的同时促进骨生长。研究发现，与其他比例(76/24、63/37、56/44)HA/β-TCP、纯HA和纯β-TCP支架相比，种植人MSC的HA/β-TCP(20/80)支架具有最高的成骨速率[28]。但目前只有HA/β-TCP(65/35)、HA/β-TCP(60/40)和HA/β-TCP(50/50)在人体临床试验中成功应用[29]。此外，无机材料还可与有机聚合物组成复合材料，如PLGA/TCP、PCL/TCP和PLGA/HA等。有研究通过低温3D打印技术，以PLGA/TCP复合材料为载体，将多种骨诱导活性分子(淫羊藿素、淫羊藿苷、丹酚酸B、金属镁等)融入PLGA/TCP生物墨水，构建促进骨再生多孔材料，结果显示PLGA/TCP可作为低温3D打印的理想生物墨水，用于负载多种骨诱导活性分子，促进骨缺损再生[30-33]。目前的3D打印技术已经开发出具有复杂内部结构的HA支架，细胞可扩散至支架深层而不会发生堵塞。因此，HA是适用于骨重建的有前途的生物材料。近年，生物活性玻璃的研究重心已转移至介孔生物活性玻璃(mesoporous bioactive glass，MBG)。结合3D技术，使用聚乙烯醇作为黏合剂制作的多功能MBG的机械强度较传统MBG显著升高[34]。Wu等[35]将MBG/丝绸支架植入小鼠的颅盖缺损中，结果发现，与纯丝绸支架和非MBG/丝绸支架相比，MBG/丝绸支架Ⅰ型胶原蛋白的表达和新骨形成均显著增加。但MBG脆弱易碎、机械强度低，限制了其在骨组织工程学中的应用。将MBG与生物聚合物(如PCL)结合可提高机械强度。Yun等[36]提出，可在MBG/PCL支架上进行细胞外基质组分预涂，使其具有足够的机械性能和良好的3D互联孔结构。

3 用于骨组织工程的生物活性因子或细胞

3.1生长因子在组织工程中的应用 在组织工程学中，可将生长因子与可生物降解载体结合，载体可提供一定的机械强度，而生长因子的持续缓释可增加其在生物体内的浓度，刺激细胞的黏附、增殖和分化，促进骨和软骨的再生，同时还可避免全身性使用的不可预测后果，如缺乏长期稳定性、剂量依赖性所导致的致癌性等。有研究提出，可将复合支架与成骨细胞、生长因子或骨形成蛋白结合形成新的传递载体[37]。BMP作为重要的内源性骨诱导因子之一可诱导成骨反应和骨形成，其中BMP-2和BMP-7是骨髓MSC(bone marrow MSC，BMSC)骨分化过程中的有效刺激因子[38]。Wang等[39]制作了结合基因工程的3D打印双功能支架，实现了在多西环素介导下释放BMP-2；进一步研究显示，多西环素介导释放的BMP-2可导致成骨细胞分化能力、诱导骨组织形成能力均显著增强；同时，多西环素还具有广谱抗菌能力，可防止感染的发生，并可修复感染性骨缺损。此外，转化生长因子、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、成纤维细胞生长因子等特定信号分子也可促进组织生长。Chen等[40]研究发现，衰老可损害BMSC对IGF-1的促有丝分裂活性和成骨潜能，研究者将过表达IGF-1的衰老BMSC接种到海藻酸钙支架，结果发现衰老的BMSC中的IGF-1过表达可促进支架中的细胞簇形成，导致细胞簇内部的细胞存活率增加，从而诱导成骨细胞标志物的表达，增强细胞簇的生物矿化作用，表明IGF-1过表达可增强细胞的成骨能力。Lee等[41]将聚多巴胺和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)直接移植到支架表面以诱导有效血管生成过程，结果发现，对血管生成十分重要的CD31的表达增加，原因在于VEGF与VEGF受体2结合可增加VEGF受体2的信号转导，导致VEGF的血管生成活性增强。BMP-2、VEGF和碱性成纤维细胞生长因子之间的组合还会对人脐静脉内皮细胞血管生成过程产生协同促进作用，在血管活化初期阶段添加成纤维细胞生长因子-2与VEGF、在血管成熟阶段添加BMP-2，均可产生更强的体内外血管生成反应[42]。

3.2细胞在组织工程中的应用 由于骨骼与软骨组织具有独特的组织生长机制、物质代谢和不同成分，目前开发的骨-软骨双层复合支架即是利用不同材料之间的优点促进骨软骨细胞的生成。骨-软骨双层支架不是在单一结构中恢复骨和软骨的功能，而是模仿不同组织的天然细胞外基质。有研究者提出，可将成骨细胞与软骨细胞共培养，然后再移植到支架中以模拟功能化的软骨-骨界面，从而促进成骨细胞与软骨细胞的生长和分化[43]。Wu等[44]制作了软骨细胞/成骨细胞负载的β-TCP生物陶瓷支架和软骨细胞负载的β-TCP生物陶瓷支架，并用于小猎犬关节软骨缺损的治疗，结果显示，软骨细胞/成骨细胞负载的β-TCP生物陶瓷支架的股骨滑车相对软骨再生能力>软骨细胞复合β-TCP生物陶瓷支架>β-TCP生物陶瓷复合支架。目前，双层支架主要包括3种类型：①单一不均匀支架，将软骨组织或软骨细胞直接种植于骨支架基底上的新骨组织；②组合式双层支架，将两种不同的软骨支架和骨支架连接组装在一起；③一体化双层支架，将两个不同部分组成的双层支架通过共有的共同材料融合在一起[45]。MSC也是骨组织工程学中的良好应用材料，其具有分化为多种不同结缔组织(如软骨、骨骼、肌肉和肌腱组织)的能力[46]。BMSC作为多能干细胞可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，因此可应用BMSC提高关节炎中软骨缺陷的内在修复潜能[47]。

4 复合支架的孔径设计

天然骨组织是孔隙率为50%～90%、孔径为1 mm的多孔环境[48]。相关研究证明，支架的孔结构是细胞分化、增殖以及新组织再生的重要因素[49-51]。孔间连接是重要参数，其可在没有血液供应的情况下，帮助运输氧气、营养物质和代谢废物，同时还可作为血管的形成途径，为了获得良好的孔间流动性，建议孔间连接应为15～50 μm[52]。同时，骨组织工程支架的孔径率和孔径大小也会影响细胞的生长发育、附着以及生物降解和药物释放速率，因为孔径率和孔径大小可决定支架的表面积[53]。孔径减小可增加支架的表面积，从而促进细胞的相互结合以及细胞与支架表面的相互作用。若孔径太小，细胞可能难以迁移至支架结构中，因此支架的孔径大小应有利于细胞反应过程。骨形成中，细胞生长的孔径为100～150 μm，而血管形成中则要求孔径>300 μm[54-55]。目前，骨组织工程中开发的主要支架见表1。

表1 骨组织工程中开发的支架

5 小 结

骨缺损的修复过程复杂且困难，因此作为替代传统骨重建方法的骨组织工程学中的骨修复材料的选择十分重要。骨组织工程学复合支架的物理和化学特性、支架的设计方案以及材料之间的相互作用均可影响细胞诱导分化的作用。因此，未来还需要进一步在动物模型中进行体内研究，根据骨缺损修复的情况研究支架的整合能力、骨骼中的血管形成、可能出现的炎症反应以及在生物体内的长期稳定性，并更好地将实验室数据转化为临床相关策略，为骨缺损的修复提供新思路。