顶空气相色谱内标法快速测定奶茶中乙醇的含量

欧阳丽，黄 辉，钟菲菲，杨 韵

（1. 长沙市食品药品检验所，湖南 长沙 410013；2. 湖南省市场监督管理局缺陷产品召回服务中心，湖南 长沙 410131）

近几年奶茶饮品发展迅速，广受消费者喜爱，由此带动奶茶市场蓬勃发展，各品牌奶茶店相继出现，行业竞争激烈。为吸引更多的消费者，近期奶茶行业悄然兴起了混搭新潮流，其中以“酒精+奶茶”风头最盛。多家网红人气奶茶店都推出了“酒精奶茶”新饮品。酒精与奶茶混搭虽然新潮但暗含诸多风险。奶茶的定位可能让部分消费者忽视其中含有酒精的事实，饮后驾驶机动车辆很可能导致酒驾或醉驾，引发交通事故；酒精过敏者可能因酒精的摄入引起严重的过敏症状。尤其对于未成年人，其作为奶茶消费的主要群体，长期饮用“酒精奶茶”会对身体造成伤害，甚至导致酒精成瘾。

现行有效的国家标准中规定了酒、浓缩果汁中乙醇含量的测定方法[1-2]。酒中乙醇含量测定时常用密度瓶法与酒精计法，这2种方法均不适用于乙醇含量较低的奶茶样品。虽然“饮料通用分析方法”（GB/T 12143—2008）中规定该标准只适用于浓缩果汁[2]的测定，但依据其测定原理，奶茶中乙醇含量的测定也可参照其法。不足之处在于该标准所用方法操作繁琐，耗时长，效率低，不利于批量样品的快速检测。食品中乙醇含量检测的相关文献报道较多，主要有密度瓶法[1]、密度计法[3]、液相色谱法[4-5]、气相色谱法[6-12]和质谱法[13-16]等，但奶茶中乙醇含量的检测方法尚未见报道。

顶空气相色谱法的原理是将液态或固态的待测样品（待测组分在加热条件下易挥发）置于密闭顶空瓶或其他密闭系统中，设定加热温度，使样品中的挥发性组分挥发出来进入气相，一定时间后，顶空瓶或密闭系统中达到两相甚至三相平衡，然后将顶空瓶或密闭系统与气相色谱仪联用，收集气相样品进入气相色谱进行分析检测，间接测定出样品中待测组分的含量。该方法检测时无需对样品进行提取、净化等处理，操作简单、快速；加热平衡时样品中的水分、高沸点物或非挥发性物质不挥发不会对色谱柱造成超载和污染，分析结果灵敏、可靠、准确。该方法已用于多种基质复杂的样品中乙醇含量的测定[6,9,17-18]，尤其适用于乙醇含量低的样品。内标法通过测量内标物与被测组分峰面积的相对值来定量，可以消除因进样量、仪器不稳定等操作条件的波动对分析结果的干扰，是一种准确度高、精密度好的定量分析方法。基于以上分析，笔者拟采用顶空气相色谱内标法分析检测奶茶中的乙醇含量，旨在建立一种操作简单、绿色环保、准确方便的奶茶中乙醇含量测定方法，为食品安全监管提供有利的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

主要试剂有乙醇和丙酮（色谱纯，默克公司），超纯水（一级）。30批次奶茶样品购自当地奶茶店或超市，为不同店家或同一店家的不同款产品。

主要仪器有Agilent 7890A气相色谱仪[配置氢火焰离子化检测器（FID）和ChemStation工作站]，Agilent 7697A顶空自动进样器和20 mL顶空瓶（安捷伦公司，美国），Direct-Q8R默克密理博纯水/超纯水一体化机（密理博集团，德国），10～100 μL移液器与100～1 000 μL移液器（德国艾本德股份公司，德国）。

1.2 试验方法

1.2.1样品的制备及顶空条件优化精确量取10.00 mL奶茶样品于20 mL顶空进样瓶中，向奶茶中迅速加入50 μL色谱纯丙酮作为内标，即内标含量为0.5%（体积分数，下同），轻微转动摇匀后密封，平衡时保持顶空进样瓶直立，不振荡。试验研究了不同平衡温度（55、60、65、70、75、80℃）和平衡时间（5、10、15、20、25、30、35 min）对奶茶样品中乙醇、丙酮响应值的影响，得出最优的顶空条件。其他顶空条件参数为：GC循环时间30 min，阀温110℃，压力平衡时间1.0 min，传输线温度115℃，进样时间0.04 min。

1.2.2色谱条件优化乙醇是极性分子，根据相关参考文献[9]，选择极性毛细管色谱柱对样品进行分离分析，以保证分离效果好、干扰组分少。该研究选用的SH-Rtx-Wax毛细管柱规格为30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm。该试验重点优化了升温程序，设置了柱温恒定为170℃和程序升温2种处理，还对程序升温的初始温度、升温速率、终止温度等参数进行了不断优化。其他色谱条件参数为：进样口温度200℃，FID温度230℃；载气为氮气，流速1 mL/min；氢气流速25 mL/min；空气流速300 mL/min；分流比1∶1；尾吹气为氮气，流速为10 mL/min；进样量为100 μL。

1.2.3标准溶液的配制精确量取9份10.00 mL蒸馏水分别放入20 mL顶空进样瓶中，向每份蒸馏水中迅速加入50 μL色谱纯丙酮作为内标，即内标含量0.5%，用手轻微摇匀后，再用移液器迅速加入0、10、20、50、100、200、500、800和1 000 μL色谱纯乙醇，密封。保持顶空瓶直立，轻微转动瓶身，使物质充分混合，将乙醇配制成浓度分别为0%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、8.0%和10.0%的含0.5%丙酮内标的待测标准工作溶液，其中乙醇浓度为0%的溶液为标准空白溶液。注意：转动过程中液体不能接触到密封垫。

1.2.4基质效应取3份乙醇空白的奶茶样品，向每份样品中迅速加入50 μL丙酮作为内标，用手轻微摇匀后，再用移液器迅速加入20、50和500 μL乙醇，制成乙醇浓度为0.2%、0.5%和5.0%的空白基质配标溶液，每个浓度重复6次（n=6），相同浓度标液中乙醇与丙酮峰面积比的平均值记为A。同时配制浓度为0.2%、0.5%和5.0%的纯溶剂（溶剂为水）标准溶液，相同浓度标液中乙醇与丙酮峰面积比的平均值记为B。以A/B值评价基质效应。

1.2.5方法学验证（1）检出限与定量限。经空白奶茶加标试验，以信噪比（S/N）为3计算方法的检出限（LOD），以信噪比（S/N）为10计算方法的定量限（LOQ）。（2）加标回收率与精密度。在空白奶茶基质中加入50 μL色谱纯丙酮后，再分别添加20、50和500 μL乙醇，每个添加水平平行6次，考察检测方法的回收率与精密度。（3）日间精密度。配制3批加标水平均为0.2%的样品，室温下分别放置0、1、2和3 d进行测定，根据乙醇与丙酮峰面积比值的变化评价该方法的日间精密度。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的最佳升温程序

奶茶成分复杂，其中的挥发性组分可能干扰乙醇、丙酮在色谱柱上的分离效果，因此色谱柱柱温的设置非常关键。该试验首先将柱温恒定为170℃，在该条件下乙醇、丙酮的色谱峰不能达到基线分离，且出峰时间太早，可能存在杂峰干扰。随后将柱温改为程序升温，通过对初始温度、升温速率、终止温度等参数的不断优化，得到最佳的升温程序为：40℃保持2 min，以10℃/min升至170℃，再以20℃/min的速度升至220℃，保持3 min。按照该升温程序获得了保留时间适宜、分离度高，干扰小的色谱峰，如图1所示。

图1 奶茶样品中丙酮和乙醇的顶空气相色谱图

2.2 样品的最佳平衡温度

根据测定原理，平衡温度是影响检测结果的关键因素之一，样品平衡温度在一定范围内越高，被测组分在顶空体系中分配系数越小，在顶空瓶气相中的浓度越高；但温度越高，顶空瓶中气体压力越大，对加压取样要求更高，且过高的温度下某些物质会发生分解和氧化。从图2可知，平衡温度越高，乙醇、丙酮的峰面积越大；当温度升高到75℃后，乙醇峰面积随温度升高而增大的趋势不再明显。因此，该试验将平衡温度选择为75℃。

图2 平衡温度对乙醇、丙酮峰面积的影响

2.3 样品的最佳平衡时间

样品平衡时间也是影响检测结果的关键因素。在一定温度条件下，奶茶样品中的乙醇在气-液两相或气-液-固三相中达到分配平衡需要一定的时间。时间太短，乙醇挥发不完全；时间过长，其他挥发性物质的干扰增大，且影响分析效率。该试验考察了不同平衡时间条件下，乙醇、丙酮色谱峰响应值的变化。结果表明：当平衡时间达到15 min后，丙酮的峰面积几乎不再改变；当平衡时间达到30 min后，乙醇的峰面积几乎不随平衡时间的增加而增大。因此，后续试验将平衡时间设定为30 min。

2.4 基质效应

基质是指样品中除待测组分外的物质。基质常常会在化学分析过程中对待测组分分析结果的准确性造成干扰与影响，这种干扰与影响称为基质效应（ME）。基质效应是一种评价检验方法的有效手段。一般情况下，ME值在85%～115%范围内表明基质效应不明显[19]。顶空分析中，待测组分测定结果的准确性既与本身的挥发性有关，又与样品基质有关，特别是在样品基质中溶解度大的组分，基质效应更为明显[20]。通过计算，乙醇浓度为0.2%、0.5%和5.0%时，基质效应分别为98.52%、100.23%和100.11%，这表明基质的存在对乙醇的测定不产生干扰。因此，顶空气相色谱内标法中标准工作溶液的配制无需采用基质配标。

2.5 方法学验证

2.5.1方法的线性与检出限将标准工作溶液于仪器分析条件下上机分析后，以保留时间定性，以标准溶液中乙醇与丙酮浓度比为横坐标，乙醇峰面积与丙酮峰面积比为纵坐标绘制标准曲线（图3）。其线性方程为：y=0.282 5x-0.039 4，R2=0.998 3，表明乙醇在0.1%～10.0%l浓度范围内具有良好的线性关系。顶空内标气相色谱法中乙醇的LOD与LOQ分别为0.04%与0.1%，方法灵敏度较高。

2.5.2加标回收率与精密度从表1可知，乙醇回收率在93.98%～105.31%范围内，相对标准偏差（RSD）在1.34%～6.15%之间，表明3个加标浓度水平的回收率高，结果重现性好。加标浓度为0.2%的样品分别放置0、1、2和3 d测定含量的RSD值为6.42%，表明样品在放置3 d后精密度良好。

2.6 实际样品的测定

采用优化后的检测方法对市售的30批次奶茶样品进行乙醇含量检测，其中6批次样品检出乙醇，乙醇含量分别为0.36%、0.63%、1.85%、2.02%、2.27%和2.35%。依据GB/T 17204—2008饮料酒分类标准，酒精（乙醇）含量大于0.5%的饮料与饮品均为酒精饮料[21]。所收集的奶茶样品中有16.7%的样品乙醇含量已超过0.5%，按照分类已属于酒精饮料，应该引起相关职能部门的高度重视。

3 讨论与结论

根据GB/T 12143—2008饮料通用分析方法，常用于测定浓缩果汁中乙醇含量的方法为氧化还原滴定法，氧化还原滴定法需将样品中乙醇蒸馏出来，在酸性、恒温水浴条件下用重铬酸钾氧化后，再用硫酸亚铁铵溶液反滴定，根据重铬酸钾的加入量和硫酸亚铁铵的消耗量计算样品中乙醇的含量。与之相比，顶空气相色谱内标法测定奶茶中的乙醇时不需要对样品进行前处理，仪器自动化程度高，分析速度快，结果准确，适合批量样品快速测定（平均每个样品检测耗时小于40 min）。氧化还原滴定法需配置重铬酸钾、硫酸亚铁铵标准滴定溶液，酸碱指示液与氧化还原指示液等各种试剂，且需将乙醇从样品中蒸馏出来，恒温水浴1 h后，再进行氧化还原滴定，步骤操作繁琐，耗时较长（平均每个样品检测耗时约3 h），相比之下顶空气相色谱内标法在检测效率与操作方式方面具有明显的优势。

通过对顶空条件与气相色谱条件的优化，建立了气相色谱顶空内标法测定奶茶中乙醇含量的方法，并考察了其方法学指标。该方法在0.1% ～10%浓度范围内线性良好（R2＞0.998）；灵敏度高，当取样量为10.00 mL时，该方法检出限为0.04%；通过对样品的加标回收和样品中目标物质的反复多次验证，测试结果表明，该方法精密度和准确度高，样品中加标回收率达93.98%～105.31%。顶空气相色谱内标法不需要对样品进行预处理，操作简单，耗时短，且仪器自动化处理，检测效率高，内标的加入又很好地解决了顶空法样品分析重现性差的不足，提高了分析的准确性，适用于在实验室快速批量检测奶茶样品中乙醇的含量，为市场监管部门规范奶茶中添加酒精的乱象提供了一种有力的技术支撑。