投喂EM 菌对池塘水质和罗非鱼生长性能、抗氧化、非特异性免疫的影响

欧阳贤华，陈福艳，陈丽霞*，黎建斌*，李大列，梅宁

（1.广西安桂水产养殖有限公司，广西 南宁 530228；2.广西芳草安桂生物科技有限公司，广西 南宁 530001；3.广西壮族自治区水产科学研究院，广西遗传育种与健康养殖遗传重点实验室，广西 南宁 530021）

近20年来，随着罗非鱼（）养殖产业的快速发展，养殖技术不断完善，已颇具规模。但随着养殖面积不断扩大，密度不断增加，水环境持续恶化，病害频繁暴发，特别是链球菌病，给养殖业带来较大的损失。养殖户在病害防治过程中，由于防治技术水平参差不齐、病急乱投医和节省成本等原因，发病季节大量频繁地滥用药物，造成食品安全、环境污染、产生耐药性和抗药性等隐患。因此，一方面如何在养殖过程中有效改善水质，快速修复水体环境，减轻环境污染的压力；另一方面，如何增强鱼体免疫力，减少病害发生和药物使用，成为当今罗非鱼养殖产业健康发展的关键问题。

有效微生物群（Effective Microorganisms, EM）为复合微生物菌群，被广泛应用于环境保护、农业和养殖等领域，取得了显著的经济效益和生态效益。EM菌在水产行业上的应用，通过外泼达到较好的净化水质、提高水体自净能力的目的；内服可增强机体免疫力，促进生长和提高成活率。胡京、夏来根等、张卫芳、田功太等、马江耀等在海渗、青虾和淇河鲫等养殖池塘使用EM 菌，达到较好的调节水质、促进生长和提高免疫力的目的。但通过定期投喂EM 菌，对罗非鱼养殖池塘水质和罗非鱼生长性能、抗氧化及非特异性免疫方面的研究尚未见报道。现于2018年4月在广西某罗非鱼养殖基地，采用定期投喂EM 菌的养殖模式，分析其对池塘以及罗非鱼的生长性能、血清抗氧化和非特异免疫指标的影响。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验位于广西某罗非鱼养殖基地，该基地向阳通风、规划整齐、交通便利、排灌方便。试验池塘为4 口（1、2、3和4塘），面积分别为2.53，2.73，3.00，2.87 hm。每口池塘均配备3 kW 叶轮式增氧机3 台，150 W 自动投料机1 台。

将4 口鱼塘分为2 组，对照组（1塘）与试验组（2、3和4塘），分别投喂不同饲料。对照组（1塘）只投喂基础饲料；试验组（2、3和4塘）投喂基础饲料加EM 菌液，每隔3 d 拌料投喂1 次，EM 菌液添加量为饲料量的4%，定期投喂直至收获。

1.2 EM 菌发酵

EM 菌种由广西助农畜牧科技有限公司提供；培养基（碳源）由南宁欧海生物科技有限公司提供。EM 菌发酵方法根据说明书，材料质量比为：m（EM菌）∶m（碳源）∶m（自来水）=1∶3∶18。将其充分搅拌均匀，密封于塑料桶（100 kg）内发酵2～3 d，避免阳光暴晒，1 次未用完的发酵液，密封保存备用。

1.3 清塘与放苗

开春后，当水温高于20 ℃时，开始清塘、蓄水和消毒。4月3日投放苗种，水温21～23 ℃；罗非鱼养殖面积、苗种规格和放养密度见表1。

表1 各池塘罗非鱼种苗投放情况

1.4 饲养管理

试验鱼的投喂按照“定时、定量、定点和定质”的“四定”原则，同时视天气、水温和鱼的摄食情况适当调整。每天投喂2 次，08：00 和16：00，投喂量早期按体质量的4%～5%，中后期按体质量的2%～3%，以40～60 min 吃完为宜。视水质情况，每月加注新水10～20 cm；每天开启增氧机，中午1～2 h，夜间2～5 h。每天早晚巡塘，发现问题及时处理，做好养殖日志。

1.5 水质与病害监测

每月定期采用奥克丹便携式测水仪（I 代）测定溶解氧（DO）、铵态氮（NH-N）、亚硝酸盐氮（NO-N）和pH 值。病害监测方法为常见鱼病检查及细菌分离方法。

1.6 生长性能、血清抗氧化和非特异性免疫指标测定

养殖后期，大部分罗非鱼达到500 g/尾的上市规格，对其进行随机抽样，测量生长性能（体长和体质量），数量为30 尾/口，测量方法按照常规方法进行。另外，随机抽取罗非鱼10 尾/口，抽取血清检测抗氧化指标和溶菌酶的活力。尾静脉抽血，操作缓慢，将血液置于1.5 mL EP 管，于4 ℃冰箱静置4 h 后，离心（4000 r/min，10 min），取上清液分装于1.5 mL EP 管，-80 ℃保存备用。

血清中的总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、溶菌酶（LZM）的活力和丙二醛（MDA）含量的测定均采用南京建成生物工程研究所试剂盒。

1.7 数据统计分析

检测数据通过Excel 2016 软件进行初步处理并分析；采用SPSS22 软件进行单因素分析（Oneway ANOVA），Duncan 氏多重比较，结果采用“平均数±标准差”表示，P<0.05 为差异具统计学意义。

2 结果与分析

2.1 池塘水质

连续4 个月对池塘水质检测，结果见图1（a）（b）（c）（d）。由图1 可见，ρ（DO）不断升高，但到9月有所下降，试验组（2、3和4塘）ρ（DO）比对照组（1塘）高，但是各组之间差异不显著；养殖早期ρ（NH-N）和ρ（NO-N）较低，但到高温投料旺季，各组的ρ（NH-N）和ρ（NO-N）都有所升高，且试验组（2、3和4塘）ρ（NH-N）和ρ（NO-N）比对照组（1塘）低，但各组间差异不显著（P<0.05）；pH 值在养殖过程中略有上升，试验组（2、3和4塘）上升的幅度比对照组（1塘）小，但各组间pH 值差异不显著。可见投喂EM 菌液，有助于提高池塘的ρ（DO），降低ρ（NH-N）和ρ（NO-N），稳定pH 值。

图1 养殖过程中池塘水质变化情况

2.2 试验鱼生长性能

各池塘鱼抽样测量生长性能，结果见表2。各池塘罗非鱼平均体长和平均体质量差异显著，试验组（2和3塘）的平均体长和平均体质量均大于对照组（1塘）；试验组（2和3塘）全部达到上市规格（500 g 以上），而1和4塘罗非鱼规格次之；从抽样结果推算各池塘产量，试验组（2塘）和对照组（1塘）最高，试验组（3塘）次之，而试验组（4塘）最低。

表2 罗非鱼抽样检测生长性能结果①

2.3 试验鱼血清抗氧化及非特异性免疫

各池塘罗非鱼血清抗氧化及非特异性免疫检测结果见表3。试验组（2、3和4塘）血清中TAOC显著高于对照组（1塘），且各组之间差异显著；试验组（2和3塘）的血清CAT 活力显著高于对照组（1塘），而试验组（4塘）CAT 活力显著低于对照组（1塘）；试验组（2和4塘）的血清SOD 活力显著高于对照组（1塘），而试验组（3塘）SOD 活力显著低于对照组（1塘）。试验组（3和4塘）的血清LZM 活力显著高于对照组（1塘），而试验组（2塘）LZM 活力显著低于对照组（1塘）。试验组（2、3和4塘）血清MDA 含量显著低于对照组（1塘）。可见试验组（2、3和4塘）罗非鱼抗氧化能力和LZM活力相对优于对照组（1塘），而试验组（2、3和4塘）MDA 浓度显著低于对照组（1塘）。

表3 各池塘试验鱼血清抗氧化指标检测结果①

2.4 养殖过程中试验鱼病害及防治情况

罗非鱼养殖过程中，池塘曾用生石灰、二氧化氯、聚维酮碘和浓戊二醛进行消毒，定期用EM 菌液拌饲料预防病害，但在整个养殖过程中，各池塘均发生病害并造成死亡，可见以上措施并不能完全杜绝病害的发生，各池塘发病情况见表4。各池塘病害发生时间和程度不尽相同，各池塘罗非鱼死亡数量分别为对照组（1塘）死亡3300 多尾，试验组（2塘）死亡2200 尾，试验组（3塘）死亡1800 尾，试验组（4塘）死亡3600 尾；病死率分别是7.0%，4.6%，4.6%和8.5%。各池塘死亡情况不一致，对照组（1塘）、试验组（2和3塘）罗非鱼养殖早中期发生细菌性败血病并造成持续性死亡，后期少部分鱼因捕鱼造成应激死亡；试验组（4塘）在养殖早中期较为顺利，生长速度快，但在养殖后期，因增氧机出现故障，造成大规格罗非鱼缺氧死亡，损失较大。

表4 罗非鱼养殖过程中病害及死亡情况

3 讨论

3.1 投喂EM 菌对池塘水质的影响

EM 菌是复合微生物，包含有乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌和酵母菌等。将EM 菌应用于水体，发挥各种菌不同生长特性，在水体环境中进行生长繁殖，通过氧化、硝化、反硝化、氨化、硫化、解磷和固氮等作用，将水体中易引起水质恶化的剩饵、排泄物等有机物质转化或分解为无害的硝酸盐、磷酸盐和硫酸盐等物质，直接排放或被水中植物或藻类吸收利用，实现水生态环境的良性循环，起到修复和优化环境的作用。在本试验中，将EM 菌与饲料搅拌混合后投喂，其中一部分EM 菌被鱼吞食进入消化道；另一部分EM 菌散落水体，逐渐在水体中生长繁殖，形成优势菌群，从而起到调节水质的作用。本试验中，各池塘pH 值略有升高，可能与藻类生长旺盛、利用水体CO间接提升pH 值有关。而对照组（1塘）pH 值上升幅度较大，但各组间差异不显著，这一结果与马江耀等研究结果相似，EM 菌能显著提高pH 值；与张卫芳的研究结果也相似，使用EM 菌有逐渐增大pH 值的作用。本试验中，试验组（2、3、4塘）ρ（DO）在6—8月逐渐升高，9月份开始下降，可能与9月份气温开始下降、藻类不稳定有关，与刘其芝等认为EM 菌提高甲鱼养殖水体的ρ（DO）结果相同，而与马江濯等使用EM 菌对ρ（DO）无显著影响的研究结果有差异，具体原因有待研究。EM菌有助于降低水体中的ρ（NH-N），本试验中，图1显示，对照组（1塘）ρ（NH-N）达到2.2 mg/L 以上，而试验组在1.5 mg/L 左右，较对照组要低很多；ρ（NO-N）的控制效果与ρ（NH-N）类似，试验组（2、3、4塘）明显低于对照组（1塘），这一结果与高征等、李先明等和黄培铃等的研究结果一致。本试验中EM 菌投喂量为饲料的4%，对铵态氮、亚硝酸盐氮有明显的调节作用，但对DO 和pH 值的改善不显著，是否与用量有关，有待进一步研究。

3.2 投喂EM 菌促进罗非鱼生长

本试验中抽样结果表明，试验组（2和3塘）罗非鱼的平均体质量比对照组（1塘）高，试验组（2塘）放养密度、放养规格与对照组（1塘）很接近，但试验组（2塘）平均体质量比对照组（1塘）高；试验组（3塘）的密度比对照组（1塘）稍低，但试验组（3塘）平均体质量比对照组（1塘）高；试验组（4塘）鱼苗放养规格比对照组（1塘）小，试验组（4塘）平均体质量比对照组（1塘）小，可能受缺氧死亡一批大规格鱼的影响，具体原因有待研究。研究表明，EM 菌发酵饲料有诸多优点：EM 菌营养丰富，富含有蛋白质、多种维生素和矿物质等，能促进生物生长发育；各种有益菌在代谢过程中能产生生长促进因子和酶类，能提高生物机体免疫力；EM 菌在肠道中发挥占位优势，被吞食的EM 菌在生物肠道中生长繁殖，形成优势菌群，在一定程度上抑制有害菌生长，减少病害发生；EM 菌发酵饲料，对生物起到脱毒和提高品质的作用，促进其消化吸收和生长。伍莉等在饲料中添加EM菌，改善了大口鲇和鲫血液指标，加快了试验鱼的生长。胡京研究认为，泼洒EM 菌改善海参肠道环境，提高饲料转化率，预防疾病，提高其生长性能。李绍戊等通过投喂及外泼枯草芽孢杆菌促进鲤和草鱼的生长，提高了饲料利用率。冯俊荣等通过投喂和外泼EM 菌的方式，提高了牙鲆的生长速度。本研究结果与以上研究结果相似，投喂EM 菌可促进鱼的生长。

3.3 长期投喂EM 菌对罗非鱼抗氧化和非特异性免疫的影响

抗氧化能力是机体应对环境胁迫的重要指标，其活性和含量随环境胁迫的发生而改变，可用于衡量环境污染程度和机体免疫能力。CAT 和SOD 是抗氧化酶系统中重要的酶类，对生物体内活性氧自由基的清除起重要作用；MDA 是脂质过氧化物反应中的最终产物，累积到一定量可导致机体细胞的损伤；LZM 是机体非常重要的非特异性免疫指标，其水平和活性直接关系到鱼类的免疫能力和健康，它通过酶解破坏病原体的细胞壁，使水分进入细胞，造成细胞的崩解，从而杀灭入侵的细菌和真菌，对机体起到积极的防卫作用。该研究中，试验组（2、3和4塘）的T-AOC、CAT、SOD、LZM 相对高于对照组（1塘），但有个别指标比对照组（1塘）低，具体原因有待研究；试验组（2、3和4塘）MDA 显著低于对照组（1塘）。可见试验组（2、3和4塘）的血清抗氧化能力相对优于对照组（1塘），可能与定期投喂EM 菌有关系，发挥了以上抗氧化酶对鱼机体的作用，具体作用机制有待进一步深入研究。