克氏原螯虾甲壳不同部位中虾青素含量、构成与体色变化研究

王晨宇，黄鸿兵，李佳佳，尹思慧，代培，俞雅文，徐宇，许志强，唐建清

（江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017）

克氏原螯虾（），又名淡水克氏原螯虾，隶属节肢动物门，甲壳纲，十足目，爬行亚目，螯虾科，原螯虾属。原产于北美洲，于1930年前后被引入中国，经过近70年的发展，已成为我国重要的水生经济动物。2021年中国小龙虾产业发展报告显示，全国小龙虾养殖面积达到145.64 万hm，养殖总产量达到239.37 万t。

1981年，Meyers 等首次从克氏原螯虾虾壳中提取并获得虾青素。虾青素（Astaxanthin）是一种类胡萝卜素，属于酮式类胡萝卜素,化学名为3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，在自然界中广泛存在，呈红色固体粉末状，脂溶性，不溶于水，对高温和光照比较敏感，且具有很强的抗氧化性，其抗氧化性是维生素E 的5 倍以上。

Wade 等研究发现，成年澳洲龙虾虾壳中虾青素的含量、结构等因素与虾壳壳色有一定的关系；虾青素与蛋白质多分子复合物壳青素的结合是龙虾壳呈现蓝色的原因。目前，有关虾青素的提取方法比较多，常见的有油溶法、碱提法、有机溶剂提取法等，其中有机溶液提取法是目前市场上比较行之有效的提取方法之一。虾青素的测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、高效薄层析色谱法、LC-MS 分析法。目前大多数检测仪器以高效液相色谱法为主，可准确区分虾青素和其他类胡萝卜素，也有研究者采用液相色谱质谱联用的方法。

现以克氏原螯虾为研究对象，利用高效液相色谱检测克氏原螯虾不同部位虾壳中虾青素含量，分析其中虾青素中游离型和酯型虾青素的相对含量，探究虾青素含量与壳色的关系，旨在为克氏原螯虾虾青素综合提取及后续相关体色研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱仪1260（美国Agilent 公司），T25 均质机（德国IKA 公司），913 pH 计（瑞士万通公司），BSA822 电子天平（赛多利斯科学仪器），移液枪（德国Eppendorf 公司），14R 离心机（Dynamica Velocity）。

试剂分别为甲醇、乙腈（德国默克公司），全反式虾青素标品（上海源叶生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

克氏原螯虾均采集于江苏省淡水水产研究所浦口基地，采集时间为2021年10月，选择同一塘口的克氏原螯虾，规格、体色均为随机抽样。总共采样9 只克氏原螯虾，分别为1～9 号，采集其头胸甲壳、尾肢壳、钳甲、足甲部位的甲壳进行试验。

1.2.2 壳色测定

采用HSB 模型对虾壳壳色进行测定，其中H为色调（°），S 为饱和度（%），B 为亮度（%），采样前进行拍照，记录壳色，设备为佳能m 6 微单，图像分析采用Adobe Photoshop CS6（美国Adobe）软件，测定虾壳不同部位颜色。

1.2.3 游离虾青素的测定方法

1.2.3.1 样品的提取

称取样品搅拌加无水硫酸镁、均质器、丙酮（20 mL）提取2 次；取2 mL 样品提取液，加入2.9 mL 0.02 mol/L NaOH 甲醇过夜，涡旋混合后充氮密闭，在4 ℃冰箱中反应12 h；然后在溶液中加入0.1 mL 0.6 mol/L 磷酸甲醇中和剩余的碱，再加100 mg PSA混匀静置上机。

1.2.3.2 色谱条件

色谱柱：Cremo-LC-026 柱；流动相：甲醇30%乙腈70%；流量：1.0 mL/min；检测波长：476 nm；检测器：紫外检测器；进样量：10 μL；柱温：35 ℃。分别取样品溶液和虾青素标准品在相同条件下洗脱。游离虾青素含量测定换算公式如下。

式中：ρ——样品质量浓度，μg/mL；

V——样品体积，40 mL；

m——样品质量，g；

ω——总虾青素含量，μg/g。

标准曲线为y=100.0643 x-7.1980（R=0.99946），表明虾青素在0～12 μg/mL 线性关系良好，可用于虾青素总量的测定。

1.2.4 游离型和酯化型虾青素测定方法

根据《水产品及其制品中虾青素含量的测定高效液相色谱法》（SC/T 3053—2019），对样品进行皂化处理，皂化后测定的为酯化型和游离型虾青素的总量，第一次未皂化测定的为游离型虾青素的总量，将其减去第一次测定的虾青素量即为酯化型虾青素的含量。皂化后总虾青素含量测定换算公式如下。

式中：ρ——样品质量浓度，μg/mL；

V——样品体积，40 mL；

m——样品质量，g；

ω——总虾青素含量，μg/g。

标准曲线为y=103.7193 x-8.3930（R=0.99944），表明虾青素在0～12 μg/mL 时，线性关系良好，可用于虾青素总量的测定。

1.3 数据统计学分析

测定结果采用（平均值±标准差）（n=3）表示；采用Gragh Pad Prism 6 软件绘制图形。

2 结果与分析

2.1 不同部位虾壳中总虾青素含量差异分析

采用有机溶剂提取克氏原螯虾不同部位的虾壳虾青素，采用高效液相色谱分析，结果见图1（a）（b）。由图1 可见，虾青素标准品（游离型）在5.6 min附近处有特征吸收峰，为全反式虾青素；在6.7 和7.1 min 处分别出现特征峰，为13-顺式虾青素和9-顺式虾青素。洗脱时间表明，克氏原螯虾不同部位均有游离型全反式虾青素存在。

图1 虾青素高效液相色谱图

将对虾壳提取物进行皂化操作，将其中酯化性虾青素转化为游离型虾青素，测量总虾青素含量。不同编号克氏原螯虾虾壳总虾青素含量对比见图2（a）（b）（c）（d）。由图2 可见，总虾青素含量最高值为3 号尾肢壳（311.37±0.16）μg/g，最低值为8 号钳壳（35.25±0.05）μg/g，同规格克氏原螯虾尾肢壳虾青素总量高于其他部位，头甲壳和钳壳含量相近，足壳中含量最少。

图2 不同编号克氏原螯虾虾壳总虾青素含量对比

2.2 不同部位虾壳游离和酯化虾青素含量差异分析

虾青素六元环上的羟基能够与脂肪酸结合形成虾青素脂肪酸酯。虾青素酯类在477 nm 附近也有特征吸收，但是因为疏水性高于游离型，所以洗脱时间长、出峰时间晚。样品中待测物采用丙酮或二氯甲烷-甲醇混合溶液提取，经碱皂化，其中的虾青素酯转化为游离态虾青素。

不同编号克氏原螯虾虾壳中游离型虾青素和酯化型虾青素含量对比见图3（a）（b）（c）（d）（e）（f）。由图3 可见，游离型虾青素含量最高值为4 号尾肢壳（140.29±0.19）μg/g，最低值为7 号足壳（20.65±0.07）μg/g。酯化虾青素含量最高值为3 号头甲壳（164.78 μg/g），最低值为2 号足壳（7.02 μg/g），酯化虾青素量在头胸甲和尾肢甲中含量高于游离虾青素，而在虾足壳中含量相似，游离型和酯型虾青素的相对含量比例各不相同，差异较大，这可能由于选样的克氏原螯虾在大小规格体色上差异较大。由此可见，游离型虾青素和酯化虾青素的比例可能随着龙虾性征的改变而发生改变。

图3 不同编号克氏原螯虾虾壳中游离型虾青素和酯化型虾青素含量对比

2.3 不同部位虾壳中虾青素含量与结构差异和壳色深浅之间的关系

HSB 模型分析克氏原螯虾虾壳壳色见图4（a）（b）（c）（d）（e）（f）（g）（h）（i）。根据HSB 颜色模型，色调越近0 点红色加深，饱和度S 色，亮度B 越高色彩越明亮。运用Adobe Photoshop CS6 对其进行HSB 模型分析，分析后数值经Gragh Pad Prism 6处理后得到图5（a）（b）（c）（d）（e）（f）。

图4 不同编号克氏原螯虾HSB 模型体色分析。

由图3 和图5 可见，游离虾青素含量较高的虾普遍会呈现较深的壳色，色彩偏暗，饱和度也会较低，游离虾青素含量较少，趋向于浅红或者麻青的壳色，而色彩较明亮，饱和度较高。

图5 不同编号克氏原螯虾壳色的比较

3 讨论

克氏原螯虾获得脂溶性类胡萝卜素只能通过摄食，然后由代谢过程转运至色素细胞中。该试验选择了同一塘口同一批次的克氏原螯虾，规格多为5～8 cm 的红壳虾和青壳虾，红壳虾性腺发育阶段大多处于II、III 期，而青壳虾性腺发育阶段大多处于I、II 期，但也有部分5 cm 左右红壳小虾，性腺未成熟却呈现红色的状态，这与郭风英等、龚志等研究结果相似。由此可见，大部分的试验可以证明体色并非判定性成熟的标志之一。费志良等认为青壳原螯虾是当年红壳虾蜕壳越冬后呈现的状态。费志良等还发现红壳虾生长速度较慢，含肉率偏低，但营养较为丰富，青壳虾生长速度较快。本试验对克氏原螯虾虾壳进行HSB 模型分析发现，随着壳色值的降低，壳色不断加深，游离虾青素的含量越高，说明虾青素含量的变化直接导致克氏原螯虾壳色的改变。

黄永裕等研究不同类胡萝卜素添加对中华锯齿米虾（）红色品系体色的影响。结果显示，天然虾青素、螺旋藻、人工虾青素、叶黄素对体色黄色值改善效果依次提升。河蟹的体色也基本取决于其类胡萝卜素含量，虾蟹类水生动物一般不能自身合成类胡萝卜素，将食物中的类胡萝卜素直接转化为自身所需要的类胡萝卜素，当虾蟹机体出现应激反应时，虾青素可清除其体内的活性氧自由基。因此，体色的变化还有可能受到外部环境刺激所致，类胡萝卜素摄入量和消耗量的变化同样对虾蟹类的体色具有较大的影响，增加了对虾蟹体色与虾青素含量探究的不确定性。该试验中，选择的克氏原螯虾均来自同一塘口，受到不同环境刺激的可能性较小，但在运输过程中部分虾有应激反应，其对虾青素含量变化的影响程度有待进一步研究。

4 结论

采用高效液相色谱检测其虾壳不同部位虾青素的含量，分析克氏原螯虾甲壳颜色与虾青素含量的关系。结果表明，克氏原螯虾尾肢壳虾青素总量高于其他部位，头甲壳和钳壳含量相近，足壳中含量最少；克氏原螯虾壳色与游离虾青素的含量有着密切的关系；游离型虾青素和酯化虾青素的比例可能随着龙虾性征的改变而发生变化。今后，可以通过研究虾青素形态变化的基因，进一步探究克氏原螯虾体色变化的具体调控机制，为克氏原螯虾养殖业发展提供参考。