基于响应面法优化拮抗大丽轮枝菌枯草芽孢杆菌BS-Z15发酵培养基

宁焕宸，吴梦君，赵惠新，刘会强＊

（1.新疆特殊环境物种保护与调控生物学自治区重点实验室，新疆师范大学 生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院，湖北 武汉 430032）

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）广泛分布在土壤及腐败有机物中，具有生长速度快、对营养要求低、易培养、可拮抗真菌等特点，在分解生产废料、降解环境污染物、进行生物防治等方面已有应用［1-5］。据报道，一些枯草芽孢杆菌能够产生伊枯草菌素和短杆菌肽等脂肽类物质，对多种病原菌及条件致病真菌有高效拮抗作用［6-8］，有些芽孢杆菌所产生的多种酶［9-12］以及天然活性产物［13-17］，可作为农业饲料添加剂和水体净化剂［18-20］，这些代谢产物还可以提升动物体免疫水平［21］。近年来，枯草芽孢杆菌已成为生防菌和发酵工业工程菌的筛选菌种资源菌种［22-27］。

BS-Z15是分离于新疆棉花根际土壤的枯草芽孢杆菌，该菌发酵产物具有高效、稳定的广谱抗真菌特性，可以有效拮抗大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）［28-29］，具有巨大的生物防治棉花黄萎病潜力。有研究发现，不同亚种的枯草芽孢杆菌对培养基中营养物质的需求和利用率存在差异［30-32］，其中，碳源、氮源和无机盐的种类和浓度是培养基中重要的发酵原料。筛选获得适合BS-Z15 高效发酵的优化培养基，是利用其发酵产物进行黄萎病防治等生产应用的前提要求。本研究在前期明确了枯草芽孢杆菌BS-Z15在发酵18小时后产生抗真菌活性物质较多的基础上，以牛肉膏蛋白胨培养基为对照，以OD600nm吸光值读数作为菌体生长浓度指标，以发酵产物浓缩后对大丽轮枝菌抑菌圈直径为抗真菌活性物质产量指标，比较不同氮源、碳源和无机盐对枯草芽孢杆菌BS-Z15 菌体生长和抗真菌活性物质产量的影响，筛选最优氮源、碳源和无机盐，并利用响应面法分析并优化三者浓度配比，为提升枯草芽孢杆菌BS-Z15的发酵效率奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种及试剂

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS-Z15：由新疆师范大学生命科学学院实验室分离、鉴定、保存。

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）：Verticillium dahliae 991（以下简称Vd）由新疆农业科学院提供。参照文献［32］方法制备Vd孢子并制备双层板，置于4℃冰箱备用。

所有试剂均购自北京奥博星试剂公司，为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 BS-Z15拮抗大丽轮枝菌发酵产物制备

以牛肉膏蛋白胨培养基（NB）为基础发酵培养基，参照赵君洁［33］等提出的方法进行液体培养BS-Z15 18小时（37℃，180rpm），检测菌液OD600nm，并采用酸沉淀及正丁醇抽提法获得抗真菌活性产物粗提物，将来源于100mL发酵液的粗提物溶解在0.5mL去离子水中备用，进一步采用双层板法［33］检测抗真菌活性，用于反映抗真菌活性物质产量。

1.2.2 最适碳源、氮源、无机盐筛选

分别用3.0g/L 的葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、玉米粉、甘露醇、淀粉、山梨醇替换牛肉膏蛋白胨培养基中的牛肉膏，其余成分不变，制备培养基并进行BS-Z15 发酵，对比不同碳源对BS-Z15 生长及产抗真菌活性物质的影响，筛选最优碳源；分别以10.0g/L 的尿素、硫酸铵、硝酸铵、酵母浸粉、硝酸钾等替换牛肉膏蛋白胨培养基中的蛋白胨，其余成分不变，制备培养基并进行BS-Z15 发酵，对比不同氮源对BS-Z15 生长及产抗真菌活性物质的影响，筛选最优氮源；分别以5.0g/L 的FeSO4、ZnSO4、CaCl2、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O 替换牛肉膏蛋白胨培养基中的NaCl，其余成分不变，制备培养基并进行BS-Z15发酵，对比不同无机盐对BS-Z15生长及产抗真菌活性物质的影响，筛选最优无机盐。

1.2.3 最适碳源、氮源及无机盐不同浓度的响应面实验

对于筛选获得的最优碳源、氮源、无机盐，分别取三个浓度（表1），使用响应面设计软件Design-Expert 8.0.6设计实验组，并检测各实验组对BS-Z15生长（OD600nm处吸光值）及产抗大丽轮枝菌活性物质产量的影响。统计建模，预测最优培养基，并通过发酵实验进行验证。

表1 响应面分析因素与水平

1.2.4 活性产物产量检测验证方法

以0-60%连续浓度梯度乙腈溶液作为洗脱剂，以OD220nm为分离组分指示，采用HPLC法分离正丁醇提取物的各组分，用双层板抑菌实验检测各组分对大丽轮枝菌的抑制活性，确定抑菌产物色谱峰，并以其峰面积为抗菌活性物质产量指标，分析优化培养基发酵抗真菌活性物质产量。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌BS-Z15菌体生长及抗真菌活性物质产量的影响

如图1 所示，各种碳源中蔗糖、山梨醇显著益于BS-Z15 菌体生长（P＜0.05）；葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇单糖均益于BS-Z15其菌体生长量和抗大丽轮枝菌活性物质积累（P＜0.05），其中葡萄糖对抗大丽轮枝菌活性物质产量影响最佳；玉米粉、淀粉等多糖显著劣于单糖和对照（P＜0.05）。所以，以菌体生长为目标可选取蔗糖和山梨醇为碳源，以产抗大丽轮枝菌活性物质为目标，可以选取葡萄糖为碳源，同时以菌体生长及产抗大丽轮枝菌物质为目标，可选用葡萄糖作为优化培养基的碳源。

图1 不同碳源对BS-Z15生长及产抑菌活性物质量的影响（P＜0.05）

2.2 不同氮源对枯草芽孢杆菌BS-Z15菌体生长及抗真菌活性物质产量的影响

如图2 所示，不同氮源对BS-Z15 生长及产抗真菌活性物质影响极为显著，其中有机氮源显著优于无机氮源（P＜0.05），且在无机氮源培养基中，BS-Z15发酵几乎不能合成抗大丽轮枝菌活性物质。有机氮源酵母浸粉较蛋白胨能显著提高BS-Z15菌体生长速度和抗大丽轮枝菌活性物质产量（P＜0.05）。

图2 不同氮源对枯草芽孢杆菌BS-Z15发酵及产抑菌活性物质的影响（P＜0.05）

2.3 无机盐对枯草芽孢杆菌BS-Z15菌体生长及抗真菌活性物质产量的影响

对比了FeSO4、ZnSO4、CaCl2、MnSO4·H2O、KNO3、MgSO4·2H2O 各种无机盐对BS-Z15 发酵的影响，结果表明，BS-Z15 在这些无机盐培养基中均能生长，但在ZnSO4、CaCl2、KNO3作无机盐的培养基中枯草芽孢杆菌BS-Z15 的生长都显著低于对照组及其他无机盐（P＜0.05）；在CaCl2·2H2O、ZnSO4作无机盐的培养基中枯草芽孢杆菌BS-Z15 不能产抗大丽轮枝菌活性物质。在添加FeSO4、MnSO4·H2O 和MgSO4·2H2O 无机盐培养基中，显著促进BS-Z15 抗大丽轮枝菌活性物质的产量（P＜0.05）。综合分析，可能是阳离子为主要影响因素，其中Mg2+、Mn2+和Fe2+能促进BS-Z15 产抗大丽轮枝菌活性物质，尤其Mn2+和Fe2+作用更为显著，但三者对BS-Z15的菌体生长无显著作用；Ca2+对BS-Z15的生长及产生活性物质具有抑制作用。故Mn2+和Fe2+可作为优化培养基的无机盐离子。

2.4 响应面分析法优化枯草芽孢杆菌BS-Z15发酵培养基

根据上述实验结果，选择以葡萄糖（A）、酵母浸粉（B）和MnSO4·H2O（C）为优化培养基的碳源、氮源和无机盐，并对这3 个因素各自设计3 个浓度水平，采用响应面实验设计软件设计实验组，并检测各实验组对BS-Z15 发酵产抗真菌活性物质的影响，结果如表2 所示。对表2 结果进行Box-Behnken 分析，结果如表3所示，该模型失拟项P=0.1865＞0.05，R2=0.9732，相关度好。通过模型分析表明葡萄糖对BS-Z15产抗真菌活性物质的影响最为显著，其次为酵母浸粉，再次为无机盐。

图3 不同无机盐对枯草芽孢杆菌BS-Z15发酵及产抑菌活性物质的影响（P＜0.05）

表2 不同因素及水平实验设计的结果

表3 Box-Behnken分析各因素对BS-Z15抗真菌活性物质产量的影响

注：*，P＜0.05，显著；**，P＜0.01，极显著。

构建响应值对试验因子的三维空间曲面图，分析3种因素间的两两交互作用（图4），结果表明碳源（葡萄糖）和氮源（酵母浸粉）响应面图形陡峭，交互作用最强，碳源（葡萄糖）和无机盐（硫酸锰）响应面图形平稳，交互作用相对较弱。

图4 响应面法分析各因素对BS-Z15活性物质产量的影响（P<0.05）

对试验数据进行回归拟合，可得到抗大丽轮枝菌活性物质Y 的产量（抑菌圈直径大小）和各因子（A，B，C）之间的回归方程如下：

根据模型预测得出，当葡萄糖浓度为11.61g/L，酵母浸粉浓度为11.22 g/L，无机盐浓度为0.99 g/L，抗大丽轮枝菌活性物质产量到达最大值，抑菌圈理论直径为28.215 mm.对发酵培养基预测值进行验证试验，取平均值测得BS-Z15 抗大丽轮枝菌活性物质抑菌圈直径为29.1 mm.预测值与实测结果一致，表明回归方程能够比较真实地反映各因素对抗大丽轮枝菌活性物质产量的影响。

2.5 活性物质主效成分鉴定及峰面积对比

使用HPLC 法对粗提物进行定量分析，得到四个显著吸收峰（图5A峰谱图中P1、P2、P3、P4四峰物质，其中P1 为溶剂DMSO），经抑菌实验鉴定，P2、P3 物质对大丽轮枝菌无抑菌活性，P4 物质具有强抑菌活性（图5B），故认定粗提物主效成分为P4物质。通过对等量发酵液分离纯化的基础培养基及优化培养基P4物质抑菌圈大小比对（图5B中P4与P4'），确定优化培养基活性物质产量更多。将基础培养基与最适培养基获得的活性物质粗提物使用液相色谱仪进行分析，结果如图5。经仪器读数分析，基础培养基活性物质P4 物质峰平均面积为14167.87 mAU*min，优化培养基P4物质平均峰面积为25131.50 mAU*min，优化后主效物质量提升77.38%，且优化培养基中BS-Z15的生长量显著高于基础培养基（P＜0.05，图5C），达到优化目标。

图5 BS-Z15抗真菌物质主效成分的分离鉴定

3 讨论

研究表明，枯草芽孢杆菌属因其能够产生多种有效抑制病原微生物的次生代谢产物，正在成为研究的热点。越来越多的研究表明，枯草芽孢杆菌对营养的要求低，但不同亚种对营养的利用率也不同，因此在进行发酵条件探究实验时，需要对单一菌种进行具体研究，探寻适合其发酵及产次生代谢产物的营养源种类。

枯草芽孢杆菌BS-Z15 在使用多种营养源替换的培养基后，在各培养基中均能良好生长并能产生抗大丽轮枝菌的活性物质，说明BS-Z15菌体生长及产抗大丽轮枝菌物质对营养要求低，可以高效稳定产生抗真菌物质，是一株有巨大生防潜力的菌种。

本研究证明，BS-Z15发酵培养，单糖优于二糖，二糖优于多糖。本研究仅仅采用了单种糖作为碳源进行研究，是否可以通过单糖与二糖、单糖与多糖混合来满足BS-Z15 发酵，需要进一步研究。因单糖纯化成本较高，如果采用混合糖能满足要求，将可以在提高发酵效率的基础上降低成本。

无机盐为MgSO4、MnSO4及FeSO4时能显著提高枯草芽孢杆菌BS-Z15产生抗大丽轮枝菌活性物质，Mg2+、Mn2+及Fe2+可能是抗真菌活性物质合成的酶合成所需因子；而添加Ca2+、Zn2+抑制BS-Z15 产生抗大丽轮枝菌活性物质，可能这几种离子抑制了活性物质合成的某种酶活性。而在对照培养基中没有添加Mg2+、Mn2+及Fe2+也能发酵获得真菌活性物质，推测是因为牛肉膏蛋白胨培养基中含有少量的这些必需的辅助因子。这一实验结果为进一步深入研究BS-Z15合成抗真菌活性物质的生物途径提供了思路。

在氮源筛选中，有机氮源种类较少，而获得的最优氮源蛋白胨为复杂的混合成分，且成本较高，在后续的研究中，可以选择其他氮源进行比较。

文章通过响应面法设计和筛选，获得了葡萄糖11.61g/L、酵母浸粉11.22 g/L、MnSO4·H2O 0.99 g/L 优化培养基，经过HPLC 法分析证实了优化后抗真菌活性物质产量提升77.38%，为高效发酵枯草芽孢杆菌BSZ15生产抗真菌物质奠定基础。