丙泊酚后处理对离体培养胎鼠海马神经元凋亡及cPKCγ/GAP-43信号通路的影响*

谭彬彬，张彦，张红霞，陈君

（天津大学附属天津市环湖医院 麻醉科，天津 300350）

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischaemic encephalopathy, HIE）是指围生期发生窒息，导致胎儿缺氧缺血带来的脑损伤[1]。据统计，高危妊娠产妇生产的新生儿HIE 发病率明显高于正常妊娠产妇[2]，此外胎儿宫内窘迫等也会增加HIE 发生风险[3]。妊娠期时，胎儿大脑仍处于发育期，对中枢神经系统的刺激异常敏感，HIE 会导致神经功能障碍，严重时还会发生脑瘫、癫痫等症状，对患儿生活造成严重影响。丙泊酚是一种溶于脂质乳剂的烷基酚衍生物，作为麻醉剂和催眠剂广泛应用于临床，具有起效快、恢复时间短的特点[4]。除麻醉作用之外，临床中也利用丙泊酚的神经保护作用，与右美托咪定联合治疗脑缺血再灌注损伤[5]。有研究表明，丙泊酚可以抑制炎症通路的激活，对大脑中动脉栓塞大鼠模型的神经功能发挥保护作用[6]。因此，本研究将胎鼠海马神经元进行缺氧处理，探究丙泊酚后处理对神经元产生的影响，并对其机制进行初步探究，为HIE 治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

10 只健康SD 孕鼠（孕16～18 d），购自上海睿太莫斯生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2021-0001，实验动物使用许可证号：2021-SYDWLL-00489。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂丙泊酚注射液（国药准字H20030115，10 mg/mL，四川国瑞药业有限责任公司），胰蛋白酶-EDTA 处理液（浙江联硕生物科技有限公司），DMEM/F-12 培养基（南京建成生物工程研究所），BrainPhys 神经元培养基（北京友谊中联生物科技有限公司），胎牛血清（德国默克公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），丙二醛（Malondialdehyde, MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）免疫组织化学试剂盒（上海彩佑实业有限公司），蛋白提取试剂盒、MTT 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒、Hifair®ⅢOne Step RT-qPCR SYBR Green Kit（货号：11143ES50）（上海翌圣生物科技股份有限公司），兔抗大鼠经典型蛋白激酶Cγ（classical protein kinase Cγ ,cPKCγ）、生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43）单抗、HRP 标记山羊抗兔二抗（美国Abcam 公司）。

1.2.2 主要仪器生物安全柜BSC-1000IIA2（苏州苏洁医疗器械有限公司），二氧化碳培养箱（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司），Attune 流式细胞仪（赛默飞世尔科技中国有限公司），倒置生物显微镜MI52-M（广州市明美光电技术有限公司），Odyssey 近红外成像系统（美国LI-COR Biosciences 公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养采用1%异氟醚麻醉孕鼠，在无菌条件下剖腹手术取出胎鼠。迅速将胎鼠断头，在立体显微镜下分离脑组织中海马体并剪碎，置于离心管中，加入等体积0.25%胰蛋白酶-EDTA 处理液37℃消化15 min，加入无血清DMEM/F-12 培养基终止消化，200 目尼龙网过滤，离心弃上清液，用含10%胎牛血清的DMEM/F-12 培养基吹散细胞，制成细胞悬液并计数。将细胞悬液按5×105个/mL 的密度接种到涂有聚赖氨酸的培养板中，在37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养，24 h 时将培养基全部换为BrainPhys 神经元培养基，每3 天更换1 次培养基。取培养第7 天的神经元细胞爬片，用NSE 免疫组织化学试剂盒鉴定神经元，加入1∶400 稀释NSE 抗体孵育后，DAB 显色剂显色，在显微镜下观察到海马神经元呈棕褐色。

1.3.2 实验分组将鉴定过的神经元随机分为对照组、缺氧组和丙泊酚组。缺氧组和丙泊酚组放置于90%二氧化氮NO2+10% CO2无氧培养箱中缺氧处理30 min。丙泊酚组在缺氧处理后立即吸出原培养基，加入终浓度为50 μmol/L 的丙泊酚新培养基；对照组和缺氧组换等体积的新培养基，放回37℃，5%CO2恒温培养箱孵育2 h[7]。

1.3.3 MTT法检测神经元存活率孵育2 h 后，取各组细胞加入胰蛋白酶-EDTA 处理液进行消化，将消化后的细胞加入1.5 mL EP 管，1 200 r/min 离心5 min，弃上清液，用培养基将EP 管底部细胞重悬并计数。取96孔板加入各组细胞（180 μL/孔，5 000个细胞），并设置调零孔（无血清DMEM/F-12 培养基、MTT、Formazan 溶解液），以上每组设5 个复孔。各孔中加入90 μL无血清DMEM/F-12培养基和10 μL MTT溶液，培养4 h，吸去上清液，各孔加入110 μL Formazan 溶解液，摇床上震荡10 min 使孔中结晶物质完全溶解[8]。采用酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光值（optical density, OD）。按照公式：神经元存活率=样品孔OD 值/对照组OD 值×100%，计算各组神经元存活率。

1.3.4 流式细胞仪检测神经元凋亡率加入胰蛋白酶-EDTA 处理液消化细胞，1 200 r/min 离心5 min收集细胞，用PBS 洗 涤细胞2 次，1 200 r/min 离心5 min 收集细胞，吸去PBS 加 入100 μL Bingding Buffer 将细胞重悬，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI Staining Solution，轻摇混匀，室温下避光反应10 min，加入400 μL Bingding Buffer 混匀，用流式细胞仪检测细胞凋亡率[9]。

1.3.5 比色法检测神经元SOD 活性和MDA 含量用胰蛋白酶-EDTA处理液消化各组细胞，1 200 r/min离心5 min后弃上清液，加入1 mL提取液，在超声机中破碎细胞，具体参数：200 W，3 s/次，超声30次，间隔10 s，冰浴下进行。5 000 r/min 离心10 min，取上清液，检测SOD 活性和MDA 含量[10]。

1.3.6 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）检 测cPKCγ、GAP-43 mRNA 的表达取1.3.2 中细胞，弃培养液，提取细胞中总RNA，42℃、10 min 逆转录为cDNA。qRT-PCR 扩增反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，共40 个循环。cPKCγ 正向引物序列：5'-GCCGTACCAATAACAT-3'，反向引物序列：5'-CAGATACATGACATAG-3'，长度411 bp； GAP-43 正向引物序列： 5'-GTTACATAGCATAAGAC-3'，反向引物序列：5'-TAACATAGCATTGACAT-3'，长度138 bp。以βactin 作为内参基因，采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。

1.3.7 Western blotting 检测cPKCγ、GAP-43 蛋白的表达吸去各组细胞培养基，分别加入200 μL 细胞裂解液，用移液器吸头混合15 min，吸出至1 mL EP管中，4℃、3 000 r/min 离心10 min，取上清液，用BCA试剂盒测定各组细胞蛋白质浓度。向每个细胞裂解物样品中加入上样缓冲液800 μL，100℃煮沸5 min，加入12% SDS-PAGE 凝胶，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（厚0.22 μm）上，5%脱脂牛奶封闭1 h。4℃条件下1∶500 稀释的兔抗大鼠cPKCγ、GAP-43 单抗孵育过夜，TBST 缓冲液冲洗膜，HRP 标记山羊抗兔二抗孵育2 h[11]。在Odysse 系统下观察蛋白条带，并用Image J 软件进行相对定量分析，以β-actin 为内参蛋白。

1.4 统计学方法

数据分析采用SSPS 12.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 离体培养神经元鉴定结果

免疫组织化学染色结果显示，神经元胞浆及突触呈棕褐色，细胞形态良好且饱满，轴突清晰，神经元生长状况良好。见图1。

图1 培养第7天的海马神经元（免疫组织化学染色×400）

2.2 3组海马神经元存活率比较

对照组、缺氧组、丙泊酚组海马神经元存活率分别为（100.00±0.00）%、（68.83±1.16）%和（80.17±1.66）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=910.339，P=0.000）。进一步两两比较：与对照组相比，缺氧组和丙泊酚组海马神经元存活率降低（P＜0.05）；与缺氧组比较，丙泊酚组海马神经元存活率升高（P＜0.05）。

2.3 3组海马神经元凋亡率比较

对照组、缺氧组、丙泊酚组海马神经元凋亡率分别为（7.18±0.11）%、（11.31±1.11）%和（9.02±0.19）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=50.157，P=0.000）。进一步两两比较：与对照组相比，缺氧组和丙泊酚组海马神经元凋亡率升高（P＜0.05）；与缺氧组比较，丙泊酚组海马神经元凋亡率降低（P＜0.05）。

2.4 3组海马神经元SOD活性和MDA含量比较

对照组、缺氧组、丙泊酚组海马神经元SOD 活性和MDA 含量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较：与对照组相比，缺氧组和丙泊酚组海马神经元SOD 活性降低（P＜0.05），MDA 含量增加（P＜0.05）；与缺氧组相比，丙泊酚组海马神经元SOD 活性升高（P＜0.05），MDA 含量减少（P＜0.05）。见表1。

表1 3组海马神经元SOD活性、MDA含量比较 （±s）

表1 3组海马神经元SOD活性、MDA含量比较 （±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与缺氧组比较，P ＜0.05。

组别对照组缺氧组丙泊酚组F 值P 值MDA/（μmol/L）0.31±0.07 0.56±0.12①0.40±0.09①②8.777 0.004 SOD/（KU/mL）25.41±2.71 5.86±1.03①16.57±2.13①②111.083 0.000

2.5 3组海马神经元cPKCγ、GAP-43 mRNA相对表达量比较

对照组、缺氧组、丙泊酚组海马神经元cPKCγ、GAP-43 mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较：与对照组比较，缺氧组和丙泊酚组海马神经元cPKCγ、GAP-43 mRNA 相对表达量降低（P＜0.05）；与缺氧组相比，丙泊酚组海马神经元cPKCγ、GAP-43 mRNA相对表达量升高（P＜0.05）。见表2。

表2 3组海马神经元cPKCγ、GAP-43 mRNA相对表达量比较 （±s）

表2 3组海马神经元cPKCγ、GAP-43 mRNA相对表达量比较 （±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与缺氧组比较，P ＜0.05。

组别对照组缺氧组丙泊酚组F 值P 值GAP-43 mRNA 1.33±0.19 0.61±0.10①1.10±0.16①②28.291 0.000 cPKCγ mRNA 1.07±0.21 0.58±0.08①0.81±0.11①②14.401 0.001

2.6 3组海马神经元cPKCγ、GAP-43蛋白相对表达量比较

对照组、缺氧组、丙泊酚组海马神经元cPKCγ、GAP-43 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较：与对照组相比，缺氧组和丙泊酚组海马神经元cPKCγ、GAP-43蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与缺氧组比较，丙泊酚组海马神经元cPKCγ、GAP-43 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。见表3。

表3 3组海马神经元cPKCγ、GAP-43蛋白相对表达量比较 （±s）

表3 3组海马神经元cPKCγ、GAP-43蛋白相对表达量比较 （±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与缺氧组比较，P ＜0.05。

组别对照组缺氧组丙泊酚组F 值P 值GAP-43蛋白1.17±0.21 0.38±0.09①0.81±0.14①②32.681 0.000 cPKCγ蛋白0.84±0.14 0.31±0.05①0.66±0.10①②33.941 0.000

图2 3组海马神经元cPKCγ，GAP-43蛋白的表达

3 讨论

丙泊酚是现代医学中使用最广泛的静脉麻醉剂之一。除麻醉作用外，丙泊酚对脑缺血大鼠还有神经保护作用。有研究显示，丙泊酚可以降低NMDA 受体的磷酸化程度，减少兴奋的传递，从而抑制钙离子通道开放，导致钙超载，减轻神经元损伤[12]。16～18 d 孕期的胎鼠神经系统最为敏感。因此，本研究选取该时间段的胎鼠海马神经元进行体外培养，并进行缺氧处理。

笔者在正式实验前先进行了预实验，设置不同浓度梯度的丙泊酚，分析其对正常海马神经元的影响，结果发现50 μmol/L 丙泊酚可以发挥抗神经元凋亡的作用，升高浓度后，神经元活性开始降低，因此选取50 μmol/L 作为正式研究浓度。本研究结果显示，与对照组比较，缺氧组和丙泊酚组神经元存活率降低，凋亡率上升；缺氧神经元经丙泊酚后处理后，神经元存活率升高，凋亡率下降，说明丙泊酚后处理可以保护神经元。既往研究显示，丙泊酚可以抑制海马神经元凋亡，对持续癫痫大鼠模型具有治疗作用[13]。丙泊酚后处理还可以减弱谷氨酸诱发的PC12 细胞凋亡，缓解细胞自噬[14]。SOD 是抗氧化酶，可以消除过量氧自由基发挥保护神经元的作用[15]；MDA 是脂质氧化产物，两者对氧化应激具有指示作用[16]。与对照组比较，缺氧组和丙泊酚组SOD 活性降低，MDA 含量增加；与缺氧组比较，丙泊酚组SOD 活性增加，MDA 含量减少，提示丙泊酚可以提高海马神经元抗氧化能力。有研究显示，丙泊酚对心肌缺血再灌注损伤大鼠模型具有心肌细胞保护作用，同时可以增加受损心肌细胞SOD 活性，降低MDA 含量[17]。一定剂量的丙泊酚与二甲双胍联合使用可显著提高小鼠脑组织SOD 活性并降低血清MDA 含量，促进自由基及其代谢物的清除[18]。结合以上研究与本研究结果，进一步说明丙泊酚后处理可以提高海马神经元抗氧化能力，具有神经保护作用。

本研究结果显示，与对照组相比，缺氧组和丙泊酚组cPKCγ、GAP-43 mRNA 和蛋白相对表达量降低；与缺氧组比较，丙泊酚组cPKCγ、GAP-43 mRNA 和蛋白相对表达量升高。cPKCγ 是经典PKC 亚家族的成员，在中枢神经系统中普遍表达，是参与神经保护的信号转导途径的重要组成部分[19]。上调cPKCγ 可以减轻小鼠皮质神经元缺血性损伤。GAP-43 是cPKCγ 的底物，在神经元中广泛表达。在反应性突触发生、突触前末端的生长、轴突形成和再生，以及突触可塑性的诱导中发挥重要作用[20]。有研究显示中风和外伤性脑损伤会导致GAP-43 下调[21]，并且上调GAP-43 的表达可以改善癫痫大鼠的认知功能，增加海马区神经元数量[22]。因此结合本研究结果，缺氧处理的神经元经丙泊酚后处理后，可以上调cPKCγ、GAP-43 mRNA 和蛋白的表达，减轻缺氧带来的神经损伤。

综上所述，丙泊酚后处理可以保护离体培养的胎鼠海马神经元，减轻神经损伤程度，该保护作用可能与激活cPKCγ/GAP-43 信号通路有关。这一结果为临床治疗HIE 提供了实验基础，但丙泊酚激活cPKCγ/GAP-43 信号通路的具体机制尚不明确，仍需进一步研究阐明。