白蒺藜皂苷对系统性红斑狼疮模型小鼠免疫功能和肾功能的影响*

2022-08-09王晶孟祖东方勇阿彩岭许雪

中国药业 2022年15期

王晶，孟祖东，方勇，阿彩岭，许雪

（湖北省十堰市人民医院·湖北医药学院附属人民医院，湖北十堰 442000）

系统性红斑狼疮（SLE）是一种难治性自身免疫性疾病，涉及多个器官和系统，临床表现复杂［1］。SLE 易引起全身或局部组织和器官损伤［2］。糖皮质激素可有效治疗SLE，但长期使用会引起代谢紊乱、组织愈合延迟等不良反应［3］。自身免疫系统在SLE的发病机制中非常重要，Janus 激酶（JAK）起主导作用，其异常表达或过度激活均可能导致SLE发生［4］。JAK是参与Toll样受体（TLR）信号传导的重要蛋白激酶，抑制JAK 信号通路有利于减少炎性级联反应介导的组织损伤［5］。信号转导及转录激活因子（STAT）是一种氧化还原敏感的转录因子，可调节免疫反应和炎性反应，STAT的异常表达已在SLE 中得到证实［6］。此外，JAK 是STAT 通路的关键调节因子，在自身免疫性疾病的发病中起重要作用［7］。生化实验和临床证据表明，白蒺藜皂苷具有调节免疫、控制炎症、减少西药副作用、降低感染发生率等作用［8-10］。本研究中探讨了白蒺藜皂苷对SLE 模型小鼠免疫功能与肾功能的改善作用，以及对JAK/STAT 通路的影响，为其临床治疗提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：AU-480 型全自动生化分析仪（贝克曼库尔特生命科学有限公司）；ZeissLSM880 型荧光显微镜（德国徕卡有限公司）。

试药：醋酸泼尼松原料药（上海施贵宝制药有限公司，批号为MN-569696.3）；抗双链DNA（dsDNA）抗体、抗SM、补体C3、补体C4、24 h 尿蛋白定量（24 h pro）、血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）试剂盒（贝克曼库尔特生命科学有限公司，批号分别为SD-48596.6，41529.5，52149.3，48972.7，89546.6，23984.3，51269.5）；10%苏木精染色（北京索拉尔生物科技有限公司，批号为1526963）；0.5%曙红染色（北京索拉尔生物科技有限公司，批号为5263963），Tissue-TekOCT 复合物（美国赛默飞世有限公司，批号为XD-41589.36）；0.3%Tri⁃tonX-100（美国Sigma 生物有限公司，批号为YU-526986.36）；异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的山羊抗小鼠IgG（1∶1 000，批号为ab23836），兔抗小鼠C3（1∶2 000，批号为ab23836），购于英国Abcam生物有限公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，中生北控生物科技有限公司，批号425969），Trizol试剂（美国Invitrogen有限公司，批号为CD-599696.65）；RevertAidTMM-MuLV 逆转录酶（日本Fermentas 有限公司，批号为MB-596563.36）；蛋白酶抑制剂缓冲液（美国Cell Signaling Technology 有限公司，批号为MN-658963.63）；硝酸纤维素膜（德国Schleicher&Schuell BioScience Inc 有限公司，批号为5896369）；JAK3、STAT5、GAPDH 一抗（美国SantaCruz有限公司，批号分别为CD-59693.33、XC-74856.69、KI-58741.36）；偶联辣根过氧化物酶的二抗（美国Cell Signaling Technology 有限公司，批号为56987.69）；增强化学发光试剂盒（ECL，美国Cell Signaling Technol⁃ogy 有限公司，批号为DC-574896.65）；白细胞介素2（IL -2）、肿瘤坏死因子-α（TNF -α）、白细胞介素4（IL -4）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（北京索拉尔生物科技有限公司，批号分别为B2021034、B2021095、B2021018）。

动物：12 只C57BL/ 6 小鼠，6～8 周龄，雌雄各半，体质量（25.2±2.5）g，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2018-0035，实验动物许可证号为SYXK（浙）2016-0158，购自西普尔可凯实验动物有限公司。饲养于本院实验中心的屏障环境（室温20 ℃，相对湿度40%～60%，日光12 h），隔离于全封闭清洁状态，自由饮水进食。48 只MRL/ lpr 狼疮小鼠（MRL/ lpr 小鼠第19 号染色体Faslps 突变，可自发产生系统性免疫性自身疾病，淋巴结肿大、T 细胞增生、关节炎和免疫复合物型肾小球肾炎），6～8 周龄，体质量（25.3±2.4）g，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2017-0005，实验动物许可证号为SYXK（浙）2019-0012，购自上海Slac 实验动物有限公司。饲养于浙江中医药大学动物实验中心屏障环境（室温20 ℃，相对湿度40%～60%，日光12 h），隔离于常闭无特定病原体（SPF）状态，自由饮水和进食。本研究已通过我院动物伦理协会批准。

1.2 方法

给药与分组：醋酸泼尼松组（45 mg/ kg），白蒺藜皂苷低、高剂量组（100，200 mg/ kg）MRL/ lpr 狼疮小鼠给予相应药物灌胃，正常对照组（C57BL/ 6 小鼠）和模型对照组小鼠灌胃等量生理盐水，各12只，均持续8 周。

抗dsDNA、抗SM、补体C3、补体C4、24 h 尿蛋白、SCr、BUN 测定：末次治疗后，所有小鼠空腹隔夜取血，静置30 min，离心（转速为3 000 r/min）10 min，分离取血清，同时收集小鼠24 h 尿液；采用贝克曼AU-480 型全自动生化分析仪测定抗dsDNA、抗SM、补体C3、补体C4、24 h尿蛋白、SCr、BUN水平。

小鼠肾脏病理、荧光切片制作：肾脏在4%甲醛中固定24 h，常规脱钙，脱水，用切片机切成5µm 厚的切片。二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡，无水乙醇水化，10%苏木精染色，盐酸和乙醇分化，用0.5%曙红染色1 min，乙醇、二甲苯脱水。使用LeicaDM4000B 型光学显微镜观察肾脏组织的病理变化。将速冻的肾组织用于IgG、补体C3 的免疫荧光检查，将冷冻肾组织包埋在Tissue -TekOCT 复合物中，用4% 多聚甲醛固定30 min，用0.3%TritonX-100 透化30 min，用3%牛血清白蛋白在室温下封闭30 min，用FITC 偶联的山羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠C3 在4 ℃下孵育过夜，用DAPI 染色5 min，用荧光显微镜观察染色情况。

小鼠肾脏JAK3及STAT5基因水平检测：Trizol试剂提取肾脏中的总RNA，使用RevertAidTMM -MuLV 逆转录酶将RNA逆转录成cDNA，对JAK3，STAT5，GAPDH进行反转录聚合酶链式反应（RT -PCR）。95 ℃预变性30 s后，将Rotor -Gene TM6000 PCR 系统的循环程序设置为在95 ℃下进行40次循环5 s，在56 ℃下进行30 s。当最后的循环结束时，将样品在65 ℃保持5 s，以进一步延长。序列如下，JAK3，正向5'-TACGTAGTCGATC⁃GTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTCGATCGATCGATCGCT⁃AGT -3'，反向5' -TGTCGTAGCTAGTCGATCGTAGC⁃TAGCTAGCTAGCTGATCGATCGTAGCTCG-3'；STAT5，正向5'-TGCTAGTCGTAGTCGTAGCTAGTAGTCGTAGT⁃GTCGATCGTG -3'，反向5' -TGTGATGTAGCTGATC⁃GATGTCGTAGTAGTGATGTCGTACTG-3'；GAPDH，正向5' -TGTGCTGATGATGCTAGTCGTAGCTAGTCGAT⁃GCTAGCTGA -3'，反向5' -TGTCGTATCGATCG⁃TAGCTAGTCGATCGTAGTGTAGTGTAGT -3'。每个反应重复3 次。JAK3 和STAT5 mRNA 的相对水平分别为JAK3和STAT5吸光度与GAPDH吸光度之比。

小鼠肾脏JAK3 和STAT5 蛋白水平检测：采用蛋白质印迹（Western blotting）法测定，肾组织在蛋白酶抑制剂缓冲液中裂解并匀浆，离心（15 000g）。将提取的蛋白质用7%凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS -PAGE），并将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST（含0.1%Tween-20的TBS，pH 7.4）封闭后，将膜与JAK3，STAT5，GAPDH 于4 ℃温度下过夜。洗涤后，印迹与偶联辣根过氧化物酶的二抗一起孵育。膜上的蛋白印迹通过ECL 试剂盒检测。使用Quantity One（德国慕尼黑BioRad 实验室）对测定结果进行定量。

小鼠肾组织炎性因子IL -2，TNF -α，IL -4 水平检测：取细胞培养液100µL 于96 孔板内，覆膜，37 ℃孵育2 h。弃去孔内液体，每孔加IL-2、TNF-α、IL-4 生物素抗体工作液100µL，覆膜，37 ℃孵育1 h，弃去孔内液体，每孔加酶结合物工作液100µL，37 ℃孵育1 h。弃去孔内液体，洗板5 次。每孔用200 µL 的洗涤液洗涤，浸泡2 min，弃去酶标板内的液体，在吸水纸上将酶标板拍干。每孔加入TMB 显色底物溶液90µL，37 ℃避光孵育15～20 min。每孔加入终止液50µL，终止反应，立即用酶标仪测量。采用ELISA法测定小鼠肾组织炎性因子IL-2，TNF-α，IL-4的水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 23.0 统计学软件分析。计量资料以X±s表示，采用单因素方差分析，多重比较采用LSD -t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗dsDNA、抗SM、补体C3、补体C4 水平

由表1可见，模型对照组小鼠抗dsDNA、抗SM 水平均显著高于正常对照组，补体C3、补体C4 水平均显著低于正常对照组（P<0.05）；醋酸泼尼松组，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠抗dsDNA、抗SM 水平均显著低于模型对照组，补体C3、补体C4 水平均显著高于模型对照组（P<0.05）；随着白蒺藜皂苷剂量的增加，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠抗dsDNA、抗SM 水平逐渐降低，补体C3、补体C4水平逐渐升高（P<0.05），且上述指标水平均较醋酸泼尼松组变化显著（P<0.05）。

表1 各组小鼠抗dsDNA、抗SM、补体C3、补体C4水平比较（，n=12）Tab.1 Comparison of anti-dsDNA，anti-SM，complement C3 and complement C4 levels of mice in each group（，n=12）

注：与正常对照组比较，aP <0.05；与模型对照组比较，bP <0.05；与醋酸泼尼松组比较，cP <0.05；与白蒺藜皂苷低剂量组比较，dP <0.05。表2至表4同。Note：Compared with those in the normal control group，aP <0.05；Compared with those in the model control group，bP <0.05；Compared with those in the prednisone acetate group，cP <0.05；Compared with those in the STT low-dose group，dP <0.05（for Tab.1-4）.

2.2 BUN，SCr，24 h 尿蛋白水平

由表2 可见，模型对照组小鼠BUN、SCr、24 h 尿蛋白水平均显著高于正常对照组（P<0.05）；醋酸泼尼松组，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠上述指标水平均显著低于模型对照组（P<0.05）；随着白蒺藜皂苷剂量的增加，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠上述指标水平逐渐降低（P<0.05），且显著高于醋酸泼尼松组（P<0.05）。

表2 各组小鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白水平比较（，n=12）Tab.2 Comparison of BUN，SCr and 24 h urinary protein levels of mice in each group（，n=12）

2.3 肾组织苏木精-伊红（HE）染色

由图1 可见，正常对照组小鼠肾小球结构正常，模型对照组小鼠肾小球体积变大，可见炎性细胞浸润；醋酸泼尼松组，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠肾小球体积变小，炎性细胞浸润减轻。

2.4 肾组织免疫荧光染色

由图2可见，正常对照组小鼠IgG和补体C3染色为阴性，模型对照组小鼠可见IgG 沿毛细血管袢呈不连续的颗粒样沉积，荧光强度为++++；醋酸泼尼松组，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠肾小球IgG 和补体C3 沉积情况变弱。

2.5 肾组织JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平

由表3 可见，模型对照组小鼠JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平均显著高于正常对照组（P<0.05）；醋酸泼尼松组，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠JAK3 及STAT5mRNA和蛋白水平均显著低于模型对照组（P<0.05）；随着白蒺藜皂苷剂量的增加，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平均逐渐降低（P<0.05），且均显著高于醋酸泼尼松组（P<0.05）。各组小鼠肾组织JAK3 及STAT5 蛋白表达水平电泳图见图3。

表3 各组小鼠肾组织JAK3及STAT5 mRNA和蛋白水平比较（，n=12）Tab.3 Comparison of the levels of JAK3，STAT5 mRNA and pro⁃tein in the kidney tissue of mice in each group（，n=12）

2.6 肾组织炎性因子IL-2，TNF-α，IL-4 水平

由表4可见，模型对照组小鼠IL-2，TNF-α，IL-4水平均显著高于正常对照组（P<0.05）；醋酸泼尼松组和白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠上述指标水平均显著低于模型对照组（P<0.05）；随着白蒺藜皂苷剂量的增加，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠上述指标水平均逐渐降低（P<0.05），且均显著高于醋酸泼尼松组（P<0.05）。

表4 各组小鼠肾组织炎性因子IL-2，TNF-α，IL-4水平比较（，mol/mL，n=12）Tab.4 Comparison of the inflammatory factors IL-2，TNF-α and IL-4 levels in the kidney tissue of mice in each group（，mol/mL，n=12）

3 讨论

随着免疫抑制方案和一般医疗保健措施的改进，增殖性和膜性狼疮性肾炎长期治疗结果已无差异，但SLE患者肾炎完全缓解率仍低于12%，且40%的Ⅲ～Ⅴ期狼疮性肾炎患者仍存在一定程度的肾功能损害［11］。即使在良好的情况下，免疫抑制剂对SLE肾炎的治疗效果仍远不能令人满意。因此，有必要为SLE 寻找新的药物靶点。

白蒺藜皂苷具有抗氧化、抗炎和镇痛作用，肝炎、高血压、关节炎、支气管炎、恶性肿瘤等多种疾病具有潜在的治疗作用［12］。白蒺藜皂苷诱导鼠和人CD4+T 淋巴细胞扩增为Foxp3+调节性T（Treg）细胞，可用于缓解急性结肠炎［13］。白蒺藜皂苷还可调节外周单核细胞的活性，抑制SLE相关致病细胞因子的产生，如TNF-α，IL -1β，IL -12，IL -6［14］。近期的研究表明，白蒺藜皂苷能与模式识别受体如dectin-1发生潜在相互抑制作用。Dectin -1 是一种c 型凝集素，可与TLR2 协同触发抗原呈递细胞中的先天免疫反应，诱导促炎作用。此外，TLR2 信号可能具有潜在增强体外和体内Treg 细胞增殖的作用，导致Foxp3 表达的瞬时增加［15］。本研究结果显示，模型对照组小鼠抗dsDNA、抗SM、BUN、SCr、24 h尿蛋白水平均显著高于正常对照组，补体C3、补体C4水平均显著低于正常对照组；醋酸泼尼松组，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠抗dsDNA、抗SM、BUN、SCr、24 h 尿蛋白水平均显著低于模型对照组，补体C3、补体C4 水平均显著高于模型对照组。结果表明，白蒺藜皂苷能明显抑制SLE 模型小鼠的免疫功能，并改善肾功能。由病理、荧光染色结果可知，经醋酸泼尼松、白蒺藜皂苷治疗后，各组小鼠肾小球减少，炎性细胞浸润减轻，肾小球IgG 和补体C3 沉积情况变弱。结果表明，白蒺藜皂苷可抑制SEL模型小鼠肾脏的炎性反应。

有研究表明，抑制JAK3可改善核因子-κB抑制因子α（IκBα）磷酸化，抑制免疫活性细胞中核因子-κB（NF-κB）信号传导和下游促炎细胞因子产生，减少狼疮相关的肾功能损伤［16］。STAT5 是一种广泛表达的核转录因子，在调节各种炎性介质中起重要作用，通常存在于细胞质中。IKBα的磷酸化使STAT5易位到细胞核，并诱导转录［17］。JAK3 是SLE 发展的危险因素，JAK3 抑制剂可减弱易患狼疮的MRL/lpr 小鼠和具有外周血单个核细胞（PBMC）的SLE 患者脾单核细胞中的NF-κB信号传导，同时减少小鼠中促炎细胞因子的产生。因此，抑制JAK3 活性可能有助于发现SLE 和其他炎性疾病的新疗法［18］。另有研究表明，脂多糖刺激MRL/lpr小鼠腹腔巨噬细胞后，炎性信号通路JAK3/ STAT5 和炎性因子TNF-α 及IL-6 的表达显著增加［19］。这表明脂多糖与JAK 受体，特别是JAK3 的特异性结合，异常激活STAT5 信号通路，启动免疫相关基因的转录并诱导各种炎性反应。在细胞试验中，JAK3 通过shRNA 慢病毒转染过表达，作用于MRL/ lpr 小鼠腹腔巨噬细胞，JAK3 过表达后STAT5 表达显著增加，下游炎性分子的表达增加；而抑制JAK3 表达后，JAK3 下游分子中STAT5、IKBα、IKB 激酶（IKK）和NF-κB 的表达水平降低，磷酸化水平显著降低［20］。IL -2，TNF -α，IL -4 是JAK3/STAT5 通路的下游因子。本研究结果显示，模型对照组小鼠JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平均显著高于正常对照组（P<0.05）；醋酸泼尼松组，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平均显著低于模型对照组（P<0.05），且随着白蒺藜皂苷剂量的增加，白蒺藜皂苷低、高剂量组小鼠的JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平均显著降低（P<0.05），均显著高于醋酸泼尼松组（P<0.05）；同时，IL-2，TNF-α，IL-4水平也被抑制。

综上所述，白蒺藜皂苷能明显抑制SLE模型小鼠的免疫功能，改善肾功能，其作用机制可能与白蒺藜皂苷能抑制JAK3/STAT5通路的激活有关。