CD103阳性肿瘤浸润淋巴细胞与卵巢高级别浆液性癌患者预后关系的研究

程会贤 陈名园 陈婷婷 张燕 王梅 刘天民 况薇 王巍

卵巢高级别浆液性癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSC）是卵巢癌中发病率最高的组织学类型[1]。肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）包括CD4阳性（CD4+）T细胞、CD8阳性（CD8+）T细胞、NK细胞等多个细胞亚群，对于肿瘤的发展、预后及治疗至关重要。本课题组前期的研究显示，CD8+TIL与多种肿瘤预后密切相关，在HGSC研究中亦得到相似的结果[2]。Webb等[3]研究发现，仅位于卵巢癌肿瘤上皮内的CD8+TIL与患者预后相关，这可能与上皮内CD8+TIL具有免疫记忆性有关。

记忆T细胞是肿瘤免疫记忆的主要细胞群体，包括中央记忆、效应记忆和组织驻留记忆T细胞（tissue resident memory T cells, TRM）。TRM较中央、效应记忆T细胞的免疫反应更迅速强烈，且具有组织驻留特性，可长期在肿瘤组织局部持续发挥效应[4]。TRM包括CD8+T细胞、CD4+T细胞，CD103为TRM细胞表面特异性标志物，与其配体E-钙黏蛋白（E-cadherin）结合在TRM介导其组织驻留中起到重要作用[4-5]。研究显示，CD103阳性（CD103+）TIL可改善食管癌[6]等实体肿瘤的预后，但对于CD103+TIL在卵巢癌中的表达尚未明确。因此，本研究旨在通过CD103+TIL在经初次肿瘤减灭术（primary debulking surgery，PDS）或新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NACT）的HGSC患者中的表达情况探讨其与治疗、预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 回顾性分析2018年6月至2019年6月四川大学华西第二医院收治的191例术后病理诊断为HGSC患者的临床病理资料，排除非原发卵巢癌、多发肿瘤、未行完全分期手术、术后未行化疗、失访患者54例，最终纳入137例，分为PDS组83例和NACT组54例。

1.1.2 主要试剂 免疫组织化学法一抗试剂包括：兔CD103单抗（稀释比例1∶3 000）、鼠CD8单抗（稀释比例1∶200）、兔CD4单抗（稀释比例1∶1 000）、Ecadherin（即用型抗体），CD103、CD8、CD4一抗试剂均够自英国Abcam公司；二抗试剂与DAB酶底物显色试剂、E-cadherin抗体均购自福州迈新生物技术有限公司。免疫荧光共染法中，封闭液为5%山羊血清购自爱必信上海生物科技有限公司；一抗试剂为兔CD103单抗（稀释比例1∶50）、鼠CD8单抗（稀释比例1∶100），二抗试剂为羊抗兔488单抗（稀释比例1∶500）、羊抗鼠647单抗（稀释比例1∶200），均购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 对每例患者的石蜡包埋组织选取1个位点，制成组织芯片（tissue microarray，TMA），单个芯片直径为2 mm，共制成6个蜡块。每个蜡块有30个位点（5行×6列），行5 μm厚连续切片5张。随机选取4个高倍镜下（×400）视野行CD103+TIL、CD8 +TIL、CD4+TIL计数，并求其平均值，细胞数高于平均值则为高浸润（记为high），低于平均值（记为low），并行进一步CD103highCD8highTIL、CD103lowCD8highTIL、CD103lowCD8lowTIL分组。TIL分布定位：1）肿瘤上皮内浸润：定义为癌细胞巢内或与癌细胞直接接触的TIL；2）间质浸润：定义为间质区域内未与癌细胞直接接触的TIL[3]。

1.2.2 免疫荧光共染法 采用免疫荧光共染间接法对组织芯片进行染色，使用LSM 980激光共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）进行观察，绿色荧光为CD103+TIL，红色荧光为CD8+TIL。

1.2.3 随访 通过电话和门诊进行随访，随访时间为24～36个月。术后病理确诊至患者复发、死亡或最后1次随访时间为无进展生存时间（progression-free survival，PFS）。截至2021年6月。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。组间比较采用χ²检验或Mann-Whitney检验，相关性采用Spearman检验；采用Kaplan-Meier检验行单因素生存分析，采用Cox比例风险回归模型行多因素生存分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理特征

PDS组和NACT组患者的术后复发、死亡分别为36例和14例。两组患者其他临床病理特征见表1。

表1 患者的临床病理特征

2.2 两组患者CD103+TIL、CD8+TIL、CD4+TIL与临床病理特征的关系

PDS组患者肿瘤上皮内CD103+TIL、CD8+TIL、CD4+TIL与临床病理特征均无显著性相关（P＞0.05）。NACT组患者肿瘤上皮内CD103+TIL、CD8+TIL高浸润患者的化疗敏感性较高（P=0.03、P=0.018），而CD4+TIL与临床特征均无显著性相关（P＞0.05）。

Spearman相关性检验发现，CD103+TIL表达与CD8+TIL具有显著性相关（r=0.878，P＜0.01），但与CD4+TIL无显著性相关（r=0.211，P=0.013）。CD103+TIL与肿瘤细胞表面E-cadherin表达无显著性相关（r=0.065，P=0.451）。

2.3 免疫组织化学法检测两组患者的阳性细胞计数

免疫组织化学法检测显示，NACT组CD103+TIL（P=0.026）及CD8+TIL （P=0.029）数量高于PDS组，PDS组和NACT组中的E-cadherin阳性表达率为96.39%（80/83）和94.44%(51/54）。见表2和图1，2。

表2 免疫组织化学法检测两组患者的阳性细胞计数

2.4 免疫荧光共染法检测两组患者肿瘤上皮内CD103+TIL和CD8+TIL染色

免疫荧光共染法检测显示，除个别细胞外，CD103+TIL细胞膜多出现CD103和CD8分子双阳性表达（细胞膜呈黄色荧光），CD8阴性TIL表面则无CD103表达。同时可见部分CD8+TIL无CD103表达，即并非所有CD8+TIL均可表达CD103（图3）。

2.5 单因素生存分析

PDS组的中位PFS为26.0（2.0～36.0）个月，NACT组的为20.0（7.0～36.0）个月。PDS组和NACT组患者的肿瘤上皮内CD103+TIL、CD8+TIL高浸润表达均具有预后意义（P=0.018、P= 0.004和P=0.012、P=0.005，图4）。根据肿瘤上皮内CD103+TIL、CD8+TIL表达情况，进一步分为CD103highCD8highTIL、CD103lowCD8highTIL、CD103lowCD8lowTIL组，PDS组和NACT组的肿瘤上皮内CD103highCD8highTIL组预后均最佳（P=0.013和P=0.036，图5）。

2.6 Cox比例风险回归模型多因素生存分析

CD103+TIL高浸润（HR=0.085，95%CI：0.011～0.645，P=0.017），肿瘤上皮内CD103highCD8highTIL（HR=0.020，95%CI：0.002～0.201，P=0.001），化疗敏感性（HR=19.903，95%CI：9.492～41.733，P＜0.01），FIGO分期（HR=12.023，95%CI：1.143～126.442，P=0.038）是HGSC患者独立预后因素。

3 讨论

TIL是肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中一群具有异质性的淋巴细胞，其组成包括CD4+T细胞、CD8+T细胞等多种不同的细胞亚群，在肿瘤治疗、预后与转归中扮演不同的角色，其中CD8+TIL是主要的抗肿瘤细胞[2]。但有研究发现，HGSC预后与肿瘤间质中CD8+TIL无关，仅与肿瘤上皮内CD8+TIL表达水平相关，推测肿瘤上皮内CD8+TIL是具有外周组织驻留特性的记忆性T细胞亚群（即TRM）[3]。TRM是机体屏障部位的“第一道防线”，通过释放多种促炎因子和趋化因子以及直接释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性分子来发挥免疫效应[4]。CD103为TRM的表面标志物，研究显示CDl03+TIL可改善多种肿瘤患者的预后，而且在不同肿瘤中CDl03+TIL可表达于CD4+T或CD8+T细胞亚群[6-7]。对于HGSC中的CD103表达于何种T细胞、在肿瘤中如何分布以及CD103+TIL表达水平对患者的预后影响需深入了解。

正常情况下，人体内TRM主要包括CD8+T细胞及CD4+T细胞，CD8+T细胞主要位于组织上皮层，CD4+T细胞则多在固有层及间质中存在[4]。目前，CD8+TRM细胞的发生与维持机制尚未明确，推测是由循环中CD8+T细胞进入肿瘤组织，在TME影响下表达CD103的不同水平，与肿瘤细胞表面E-cadherin相结合，将CD8+TIL锚定于肿瘤局部成为CD8+TRM，持续发挥抗肿瘤作用[8]。

本研究发现，CD8+TIL在肿瘤上皮内表达水平高于间质，而CD4+TIL则主要分布于肿瘤间质，且总数也明显少于CD8+TIL；CD103+TIL大量分布于肿瘤上皮内，间质中偶见表达，通过免疫荧光共染法证实CD103+TIL主要为CD8+TIL。本研究PDS组和NACT组中的肿瘤上皮内CD8+TIL高浸润患者预后均明显优于低浸润者，而间质中CD8+TIL表达与预后无显著性相关。此外，两组患者的CD4+TIL无论在肿瘤上皮内还是间质中均差异无统计学意义，与预后无关，这可能是由于CD4+T细胞具有双向调节功能，既可以辅助细胞免疫，也可以发挥负性免疫调节作用[9]。本研究的多因素生存分析显示，CD103+TIL高浸润为HGSC独立预后因素，基于CD103+TIL细胞膜多出现CD103和CD8分子双阳性表达，且大多定位于肿瘤上皮内，而间质中CD103+TIL表达分布较少的情况，提示HGSC患者的TME可诱导CD8+TIL表达CDl03，使CD8+TIL变为CD8+TRM长期驻留于肿瘤上皮内，持续发挥抗肿瘤免疫效应。

本研究发现，NACT组患者的肿瘤上皮内CD103+TIL和CD8+TIL表达显著高于PDS组，且高浸润患者具有较高的化疗敏感性，提示NACT可能会通过调节CD103在CD8+TIL上的表达，一方面使长期驻留于肿瘤局部中的CD8+TIL增多，另一方面还可直接增强CD8+TIL抗肿瘤能力。Chang等[10]研究就表明，铂类药物可协同增强肿瘤特异性CD8+TIL细胞作用，并增加颗粒酶或穿孔素的分泌。Miyashita等[11]也证实，乳腺癌患者接受NACT后，CD8+TIL可在癌巢聚集，而免疫抑制性FOXP3+T细胞可低表达甚至缺失。上述研究提示，NACT可调节免疫平衡，激活免疫应答而减弱免疫抑制效应，增加CD8+TIL的抗肿瘤免疫功能。有研究显示，CD103的配体E-cadherin可通过控制细胞黏附和运动在肿瘤抑制中发挥重要作用[12]，但本研究未发现NACT组的E-cadherin表达水平有明显升高，与Wang等[13]研究结果较为一致。而另一项研究表明，CD103与Ecadherin相互作用在CD8+TIL抗肿瘤应答中起重要作用[14]。上述研究结果至少说明下述问题：1）NACT能明显促使CD8+TIL表达CD103；2）肿瘤细胞所表达的E-cadherin能通过与CD8+TIL表面CD103相结合，使CD8+TIL长期驻留在肿瘤局部形成CD8+TRM；3）E-cadherin在肿瘤免疫中的生物学效应可能取决于CD8+TIL锚定肿瘤局部的能力，而非直接参与免疫应答。

综上所述，本研究发现CD103+TIL在HGSC具有重要抗肿瘤作用，CD103+TIL较CD8+ TIL是更佳的预后评估分子；因CD103+TIL能更直接反映与肿瘤细胞密切接触的TIL，CD103与肿瘤细胞膜上Ecadherin相结合后介导CD8+ TIL定位并长期驻留于肿瘤局部成为CD8+TRM，从而持续地发挥免疫杀伤作用，CD103是CD8+TIL具有更高免疫活性的体现。本研究的不足之处是CD8+TRM细胞在肿瘤局部的维持、调控以及在抗肿瘤免疫中的具体生物学过程尚不清楚，还需进行深入研究。上调CD8+TIL表面CD103表达，增加肿瘤相关CD8+TRM细胞的数量，提高免疫治疗水平，可能也是抗肿瘤研究的一个新尝试。