活血益气方对裸鼠抑瘤作用及大鼠急性毒性实验研究*

陈 菲，冯英楠，王海征，王晓萌，张 鹏，林晓兰

首都医科大学宣武医院药学部，北京 100053

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤［1］。由于浸润性生长，手术难以切除干净，放疗不敏感，化疗药物容易产生耐药，因此治疗效果不理想。中药因多靶点作用在肿瘤治疗中占有重要地位［2］。医院制剂活血益气方抗瘤丸（简称KLW）是具有自主知识产权的针对神经胶质瘤的纯中药复方制剂。临床使用近40年，安全有效，价格低廉。课题组前期进行的荷瘤裸鼠实验与小鼠最大耐受量试验证明该药有效安全，但是胶质瘤作为颅内肿瘤，在治疗时有特殊位点依赖性，故本研究采用裸鼠荧光颅内模型研究KLW的颅内抑瘤作用，更贴近临床实际，为KLW的进一步应用、研究、开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物SD大鼠，6～9周龄［北京维通利华实验动物技术有限公司；动物合格证号：SCXK（京）2016-0006］；裸小鼠BALB/c，18～22 g［北京华阜康生物科技股份有限公司；动物合格证号：SCXK（京）2014-0004］。

1.2 药物供试品医疗机构制剂KLW（京药制字Z20063103，宣武医院提供）。

1.3 试剂与仪器胎牛血清（FBS BI 1545515）、DMEM培养基（Invitrogen Corporation 1177237）、胰蛋白酶（GIBCO 903931）、水合氯醛。NAPCO 6500型CO2培养箱；CLASS TYPE B2型生物安全柜；eppendorf centrifuge 5430R型台式离心机；INDEC BioSystems Fluor Vivo 300型荧光成像仪；Leica MZ16型荧光显微镜；Leica DM3000型倒置显微镜；PB602-N型电子天平；TE2101-L型电子天平。

1.4 方法

1.4.1 裸鼠抑瘤实验

1.4.1.1 裸鼠荷瘤颅内模型建立 取源自同系小鼠皮下的U87-RFP胶质瘤组织，在解剖显微镜下切除坏死组织并将胶质瘤组织切成1 mm3大小均一的组织块。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸鼠后，无菌手术条件下，运用外科原位接种技术，将切好的胶质瘤组织块种植到实验小鼠颅内并缝合，建立红色荧光蛋白标记的人类脑胶质瘤（U87-RFP）小鼠原位模型。模型建立后第1天用荧光成像仪对所有小鼠脑胶质瘤进行非侵袭性实时成像观察。剔除瘤负荷偏离均值较大的荷瘤小鼠后将其余小鼠随机分为阴性对照组及高、低浓度KLW组各6只。阴性对照组给予溶媒，KLW各剂量组分别予高、低浓度KLW［3.4、6.8 g/kg（体质量）］，给药26天。

1.4.1.2 一般行为学和体质量检测 每天观察小鼠状况，每周称体质量2次。瘤体荧光面积：通过Fluor Vivo Model100成像系统观察实验小鼠胶质瘤负荷情况，每周2次。

瘤质量：给药26天后常规注射戊巴比妥钠麻醉处死小鼠，解剖剥离原位脑胶质瘤，并称重。肿瘤抑制率：

IR（%）=（1-治疗组瘤质量/对照组瘤质量）×100%

1.4.2 大鼠急性毒性试验

1.4.2.1 分组与给药 将SD大鼠按体质量随机分为阴性对照组和KLW组各20只。KLW组灌胃给药每日2次，间隔约4 h，单次给药容积为15 mL/kg（体质量）KLW 0.44 g生药/mL。阴性对照组饮用纯净水。

1.4.2.2 检测指标 给药后每天上、下午观察动物临床症状1次，连续观察14天；给药前后每周测体质量2次。大体剖检死亡大鼠和实验结束后所有存活动物，剖检病变器官，进行组织病理学检查。

1.5 统计学方法采用SPSS软件分析数据，进行方差齐性检验及单因素方差分析及Dunnett-t检验。

2 结果

2.1 颅内模型抑瘤实验

2.1.1 行为学观察 灌胃后各组小鼠每4天称体质量1次，最后1次称量为给药第24天，各组小鼠无卧伏无自主活动减少等现象；给药期间，各组小鼠无明显消瘦，一般状况未见明显异常，食欲正常。给药18天后各组小鼠体质量均有下降趋势。小鼠全部存活且组间比较无显著性差异，见图1。

图1 给药期间各组裸鼠体质量变化曲线

2.1.2 瘤体荧光面积 灌胃后每4天读取各组小鼠颅内肿瘤荧光面积1次，最后1次读数为给药第24天。实验结束时低剂量组祼鼠颅内肿瘤荧光面积读数较阴性对照组缩小（约缩小35%），高剂量组明显小于阴性对照组和低剂量组（约缩小44%），并且高、低剂量组与阴性对照组比较差异具有统计学意义，具有明显的量效关系。见图2—3。

图2 各组U87-RFP胶质瘤整体原位荧光成像图

图3 各组裸鼠颅内肿瘤面积生长曲线

2.1.3 瘤体质量 实验结束时，低、高剂量组肿瘤质量与阴性对照组比较明显减小，其中高剂量组差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示KLW对人源脑胶质瘤小鼠原位模型具有一定抑制作用，且该作用呈明显的量效关系。见表1及图4。

表1 各组裸鼠瘤体质量比较

图4 各组裸鼠颅内瘤体质量平均值

2.1.4 肿瘤抑制率 低剂量组IR（%）=（1-低剂量组瘤体质量平均值/阴性对照组瘤体质量平均值）×100%=（1-0.1828/0.2217）×100%=18%，高剂量组IR（%）=（1-高剂量组瘤体质量平均值/阴性对照组瘤体质量平均值）×100%=（1-0.1080/0.2217）×100%=51%，低剂量组肿瘤抑制率低于高剂量组。

2.2 大鼠急性毒性试验

2.2.1 临床症状与体质量 阴性对照组与KLW组大鼠一般状态良好，未见明显临床症状，试验期间无大鼠死亡。两组体质量基本一致。

2.2.2 病理学检查 所有存活动物未见明显大体病理学改变。单次灌胃13.2 g生药/kg（体质量）KLW后大鼠未见明显临床症状，体质量未见明显异常，未见明显大体病理学改变。

3 讨论

中医学认为肿瘤发生的病理机制多由于人体正气不足，感受毒邪所致［2］。KLW具有清热解毒，活血化瘀，化痰散结功效。北京军区总医院、天津医学院附属医院、北大一院等多中心临床试验结果显示［3］，抗瘤粉对153例脑胶质瘤的平均有效率为64.7%。回顾性研究表明［4］，院内制剂KLW可以延长恶性神经胶质瘤患者的生存时间。前期课题组研究证明KLW能够抑制裸鼠腋下移植胶质瘤模型的瘤生长［5］，其机制与抑制胶质瘤细胞C6、U87、U251的增殖作用［6-9］及上调Bax表达，导致Bcl-2/Bax比例增加，促进细胞凋亡有关［10-11］。

血脑屏障是治疗中枢神经系统疾病面临的最大阻碍，化疗药物不仅难以透过其进入肿瘤组织，且易诱导肿瘤产生耐药性，致使疗效不理想。药物能否在脑内聚集达到足够剂量和产生相应的治疗作用，一直是中枢神经系统疾病治疗的关键。本研究采用人源胶质瘤U87建立裸鼠颅内模型，同时，用荧光标记胶质瘤细胞造模，能够通过荧光成像仪实时监测肿瘤生长情况，并通过荧光面积读数得到肿瘤生长曲线。

本研究结果显示，KLW对于人源胶质瘤颅内移植模型裸鼠颅内胶质瘤具有一定抑制作用。低、高剂量组能够缩小荧光面积，减轻肿瘤质量，肿瘤抑制率分别为18%、51%，其中高剂量组与阴性对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。同时，服药期间裸鼠一般行为学无改变。急性毒性试验结果显示，灌胃最大容积最大浓度的KLW后大鼠未见明显异常，提示KLW大鼠具有较高的安全性。