肌萎缩侧索硬化致病的分子遗传学机制

马金，丰宏林

(哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科，哈尔滨 150001)

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种选择性累及上、下运动神经元的致命性神经系统变性疾病[1]，主要累及锥体束、脑干和脊髓前角细胞，临床表现为进行性加重的肌肉萎缩、无力、痉挛以及认知损害等，通常中年以后发病，表现为持续性、进行性肌肉萎缩和无力，多数患者因呼吸机麻痹在发病后2～4年死亡[2]。全球ALS的发病率逐渐升高，该病不仅给患者带来巨大痛苦，而且给患者家庭及社会造成了沉重负担。由于ALS致病机制尚未明确，因此有效治疗措施的研究也进展缓慢。研究显示，基因突变参与ALS的发病，并与疾病进展密切相关[3]。但很多导致或使人易患ALS的基因及其变异仍然未知，因而尚不能完全明确ALS的具体发病机制，这也给疾病的治疗和新药研发带来较大挑战。现就与ALS发病及进展相关的基因及其潜在的分子遗传学机制进行综述，拟为ALS更深入的致病机制研究及致病基因发现提供参考，亦为相关新药的作用靶点及诊断标志物的开发与利用提供依据。

1 ALS相关致病基因

ALS是运动神经元退变性疾病，其中10%为常染色体显性遗传，呈家族性分布，其余约90%是散发性ALS，家族性ALS的部分遗传基因也存在于散发 ALS中[3-4]。随着分子遗传技术在ALS研究中的应用，发现40%～55%的ALS由已知的ALS相关基因变异引起，目前已发现的与ALS发病相关的基因约有50个[3,5]，见表1，其中最常见的为超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)突变(20%)、C9orf72(chromosome 9 open reading frame 72)重复扩增(40%)、肉瘤融合蛋白(fused in sarcoma，FUS)(1%～5%)和交互反应DNA结合蛋白-43(transactive response DNA binding protein-43，TDP-43)(1%～5%)[6-7]。人种不同，致病基因的变异亦不同，其中欧洲人以C9orf72突变为主，占33.7%，其余依次为SOD1(14.8%)、TDP-43(4.2%)、FUS(2.8%)；亚洲人以SOD1突变为主(30%)，其余依次为FUS(6.4%)、C9orf72(2.3%)、TDP-43(1.5%)[5]。中国人群中ALS相关致病基因总体突变率在家族性ALS中为55.0%，在散发性ALS中为11.7%，其中SOD1基因突变频率最高(25.6%)，其次为FUS(5.8%)、TDP-43(5.8%)、DCTN1(Dynactin 1)(3.6%)以及C9orf72(3.5%)[8]。ALS的发病可能与氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋性氨基酸毒性、内质网应激、轴突运输障碍、RNA代谢紊乱、神经炎症及胶质细胞病变等有关，这些致病机制与ALS相关致病基因变异密切相关[3]。

表1 与ASL发病相关的基因、基因位点以及表达的蛋白质

2 ALS致病的分子遗传学机制

2.1SOD1 在ALS相关致病基因中，SOD1是报道最多且研究最为深入的基因。SOD1基因与ALS具有关联性，其编码一种含有153个氨基酸的金属酶[9]。SOD1二聚体存在于细胞质、细胞外部空间及线粒体外膜，通过将细胞呼吸过程中产生的超氧阴离子自由基歧化为O2和H2O2，而起到保护细胞免受活性氧损害，保持细胞内活性氧化物内稳态的作用[2]。目前研究已报道超过180种与ALS相关的SOD1基因变异，这些基因变异与疾病病程、表型及严重程度相关[10]，如发生A4V、H43R、L84V、G85R N86S和G93A变异者疾病进展迅速，患者生存时间短；而发生G93C、D90A或H46R变异者通常寿命较长[11]。SOD1基因特定变异者在ALS中表现出不同的临床特征，如A4V变异与四肢发作的侵袭性ALS相关，D90A纯合子患者通常表现为缓慢进展的轻瘫，而杂合子D90A变异与延髓、上肢和下肢等运动相关区域功能障碍相关，且进展较快[12]。

SOD1基因突变致使SOD1的构象和功能发生改变，从而导致ALS。研究指出，SOD1基因变异与多种蛋白质的作用相关，包括兴奋性毒性、活性氧上调引起的氧化应激、内质网应激、线粒体功能障碍等[13]。SOD1基因突变体改变机体的氧化活性，可导致有毒的羟自由基累积，破坏蛋白质折叠并损害运动神经元的轴突运输[14]。此外，SOD1基因突变体可诱导内质网应激，导致未折叠蛋白反应和内质网相关降解激活，内质网的相关降解可破坏细胞稳态，促进细胞凋亡，引起运动神经元的损伤[7]。SOD1突变可引起轴突运输损害，错误折叠的SOD1不能通过线粒体膜运输，而是在线粒体外膜积累，从而触发线粒体依赖的细胞凋亡程序，引起运动神经元凋亡[15]。亦有研究显示，野生型SOD1蛋白的错误折叠是导致ALS病情进展的重要因素[16]。

目前对于SOD1变异产生兴奋毒性的形式尚存在争议，争议主要集中在SOD1蛋白是可溶性形式还是聚集性形式。可溶性SOD1蛋白可在细胞核及细胞质中穿梭，随着可溶性SOD1蛋白累积的增加，细胞对抗应激刺激的生理防御增加，从而抑制超氧阴离子增加引起的DNA损伤[17]。研究显示，细胞核中可溶性SOD1水平越高，ALS的病程持续时间越长，两者呈正相关，表明可溶性SOD1蛋白在核室中可能具有运动神经元保护作用[17]。也有学者发现，突变或外界因素导致SOD1聚集性形式增加可导致细胞毒性增加，聚集性SOD1累积产生的毒性可破坏细胞通路，导致线粒体功能障碍、兴奋性毒性、氧化应激、内质网应激、轴突运输中断和细胞间朊病毒样增殖[10,13-17]，提示累积产生的毒性可能在ALS的发病中起重要作用。以上发现强调以减少聚集性SOD1为目标治疗ALS的潜在好处。

2.2TARTDP-TDP-43 TARTDP基因编码TDP-43[18]，其是人体内广泛存在的一类DNA转录抑制因子。TARTDP在脊髓运动神经元中的主要功能是通过与低分子量微丝信使RNA(message RNA，mRNA)结合，进而影响微丝与细胞支架的形成[18]。TDP-43是由414个氨基酸组成的DNA/RNA结合蛋白，通常在细胞核与细胞质之间穿梭，是导致ALS患者蛋白聚集的主要因素[19]。迄今为止，在不同种族中发现了40多个TARDBP变异体，大部分变异是位于转录本C端富含甘氨酸区域的错义变异[18]。研究显示，在无TARDBP基因变异的散发病例和C9ORF72变异者的脑和脊髓中泛素阳性包涵体中存在TDP-43的聚集[19-20]。TDP-43聚集成团，导致RNA代谢的正常功能丧失，进而导致脑细胞死亡或脊髓细胞神经毒性[21]，表明TDP-43基因变异是导致ALS和神经退行性变的主要原因。

TDP-43的致病机制比较复杂。TDP-43作为基因表达的调节因子参与RNA加工，包括前mRNA剪接、mRNA稳定性调控、mRNA转运、翻译以及非编码RNA调控[22-23]。TDP-43与前mRNA的3′非翻译区结合，通过反馈机制自我调节：当TDP-43过剩时，mRNA转录产物被降解而不是被翻译，致使细胞功能障碍；当TDP-43减少或耗尽时，mRNA代谢广泛失调[19]。TDP-43在转录翻译中的乙酰化、泛素化、磷酸化、蛋白水解及二硫键形成等亦被认为是ALS的潜在致病因素[24-25]。再者，细胞质中TDP-43上调形成的包涵体在细胞间传播，进而损伤神经元，导致ALS患者的运动神经元死亡和神经退行性病变[26-27]。此外，有研究报道细胞核中TDP-43的减少会抑制运动神经元轴突的再生，运动神经元中TARDBP/TDP-43的上调通过改变RNA的剪接和稳定性增加ALS的发生风险；同时TARDBP/TDP-43缺失通过下调骨骼肌中TBC1D1(TBC1 domain family member 1)蛋白导致年龄依赖性脑萎缩，进而导致神经元功能受损[7,27]。

2.3FUS FUS基因编码由526个氨基酸组成的多功能蛋白，属于家族性特发性震颤RNA结合蛋白，2009年发现FUS基因与ALS相关，主要参与基因转录和表达的调控[28-29]。FUS基因突变多呈常染色体显性遗传，与早发型和青少年ALS有关[30-31]。目前发现的与ALS相关的FUS突变超过50种[2]。在正常生理条件下，FUS主要定位于细胞核，穿过细胞质参与核质的运输，通过前mRNA剪接、RNA转运和翻译在基因表达中发挥作用，FUS亦参与DNA修复，包括DNA双链断裂修复中的同源重组和非同源端连接，并在细胞的副斑点形成中发挥防御作用[23,32-33]。因此，突变的FUS会破坏核质运输，致使细胞核耗尽，而FUS在细胞质中聚集可导致神经毒性[34]。FUS突变不仅抑制了蛋白质的整体翻译，也抑制了蛋白质的局部翻译，使树突和轴突的终末受损；同时FUS突变也会导致突触稳态缺陷和功能障碍，突触稳态维持所需蛋白的减少也可能导致ALS[35]。

运动神经退行性病变与细胞中可溶性FUS聚集直接引起的毒性相关[36]。家族性ALS中有约5%的患者会出现融合在FUS中的RNA结合蛋白突变，在这些患者中可观察到FUS阳性细胞质包涵体[33]。进一步的动物实验表明，体内FUS与RNA的相互作用可增加FUS在神经元细胞质中的聚集，加重疾病的严重程度[37]。此外，FUS变异是导致细胞功能受损而致病的直接因素，其会导致RNA剪接缺陷、DNA破坏及FUS的不能自动调节[33,38-39]。研究亦表明，FUS基因突变导致的病理性折叠蛋白可引发朊毒体的形成，导致神经退行性病变，如ALS[40]。需要特别关注的是，FUS相关ALS的致病机制是细胞核内FUS生理功能的丧失，而不是细胞质FUS聚集毒性的丧失[7]。

2.4C9orf72 C9orf72首先在欧洲人群中发现，是基因非编码区六核酸[(GGGGCC)n]重复扩增序列，其在亚洲人群中并不常见[2]。研究显示，C9orf72在ALS患者中反复扩增，mRNA和蛋白水平下降，进而导致与疾病相关的蛋白缺失[41-42]。研究显示，重复序列的G碱基增加会使转录中易形成G四倍体二级结构，从而引发一系列蛋白质的异常相互作用[41]。对ALS中与C9orf72相关通路的研究显示，RNA的错误处理是关键。首先，改变了对扩增的转录碱基本身的处理：C9orf72转录碱基包含两个交替使用的第一外显子(1a和1b)，重复扩增存在于它们之间的内含子中。转录产物产生的各种异构体包含一个或两个外显子，其存在有利于1a外显子转录的重复扩增。这导致含有重复扩增的转录产物比例增加，影响内含子重复转录的RNA处理，如转录失败、内含子重复剪接减少和核聚集[43-44]。其次，部分含有重复转录的碱基受到非血管紧张素原的RNA翻译，导致异常的双肽重复蛋白产生，进而在中枢神经系统形成神经包涵体，并可能参与疾病的发生[45]。再次，扩增的重复序列会对RNA加工产生影响。大部分C9orf72-ALS患者中发现了含有重复扩增的RNA，这些RNA位点能够与各种RNA结合蛋白发生异常相互作用，进而对RNA的表达和剪接产生影响，从而产生毒性[20,46]。

C9orf72的致病机制复杂多样，除上述蛋白丢失理论及对RNA的影响外，C9orf72还可通过诱导运动神经元中甘氨酸-精氨酸重复蛋白表达，增加DNA损伤、氧化应激及线粒体功能障碍[47]；C9orf72突变可影响泛素-蛋白酶体系统，进而诱导运动神经元死亡[48]；C9orf72变异可通过激活α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸受体，致使运动神经元通过影响神经胶质细胞对谷氨酸的摄取，使谷氨酸兴奋性增加，从而导致运动神经元的损伤甚至死亡[49]。

2.5其他基因变异 随着基因测序技术的发展，大量与ALS相关的基因被发现，这些变异主要影响RNA稳态与转运、蛋白质稳态和细胞骨架动力学。这些基因变异虽然罕见，但也为ALS的致病机制研究提供了一些线索，其中与RNA加工相关的基因有血管生成素、SETX、基质蛋白3、共济失调基因2型、TAF-15、EWSR1、异质核核糖核蛋白A1、不均一核糖核蛋白、延长复合体蛋白3，与蛋白质运输和降解相关的基因有鸟嘌呤核苷酸交换因子2、囊泡相关膜蛋白相关蛋白B/C、CHMP2B、FIG4、UBQLN2、SQSTM1、SIGMAR1、视神经蛋白、缬络胺酸蛋白质、TANK结合激酶1，与细胞骨架和轴突动力学相关的基因有DCTN1、前纤维蛋白1、SPG11、TUBA4A、NEFH、外周蛋白、NEK1，与线粒体相关的基因CHCHD10等[7]。基因变异影响ALS的表型及易感性。Diekstra等[50]研究显示，UNC13A基因突变与ALS的易感性及患者生存期相关。共济失调基因1和共济失调基因2的三核苷酸重复扩增会增加患病风险[51-52]。Uyan等[53]研究显示，EPHA3基因的变异表达与ALS发生呈负相关，被认为是ALS的潜在保护因素。综上，ALS的发病与基因变异或遗传背景有密切关系。

最近发现了一系列与ALS相关的基因。DNAJC7编码热激蛋白70，其在蛋白折叠、稳定等功能中发挥关键作用，可导致ALS模型中蛋白聚集[54]。WDR7的最后一个内含子可能与ALS有关，其扩增可导致RNA聚集[55]。酰基辅酶A合成酶长链家族成员5是一个作用于神经A1星形胶质细胞的基因，可诱导A1星形胶质细胞产生神经毒性，导致运动神经元死亡和ALS进展，酰基辅酶A合成酶长链家族成员5在ALS中的表达上调，其过表达与人类体重快速减轻有关[56]。Sigma-1受体可调节线粒体呼吸，控制细胞对内质网和氧化应激的防御，Sigma-1受体的过表达具有神经毒性，导致线粒体功能障碍，在ALS致病中发挥作用[57]。GLT8D1也被认为是ALS的致病基因，其是糖基转移酶8家族的一员，参与催化糖基的转移。GLT8D1突变可抑制糖基转移酶的正常活性，并对神经节苷脂信号转导产生负面影响，该基因的变异与ALS患者的疾病严重程度和细胞毒性呈正相关[58]。KIF5A是一个与ALS相关的新基因，KIF5A突变可影响ALS患者的发病年龄、存活时间，KIF5A的变异破坏了轴突运输，导致突触中淀粉样前体蛋白缺失，从而导致神经退行性病变[59]。虽然上述基因已被证实是ALS致病基因，但研究仍然有限，尚不完全清楚这些基因在ASL中的详细作用机制。

3 小 结

自发现SOD1突变与ALS致病相关以来，ALS致病的分子遗传学机制已经取得一系列进展。但由于ALS的病因病机十分复杂，除遗传外，与生活习惯(活动及劳动强度等)、环境(紫外线、特殊物质接触史)等也密切相关，因此目前难以对ALS的发病机制做出全面的诠释。对新的致病基因、基因修饰及其分子途径的研究可能会提高人们对ALS的认识。此外，对ALS致病基因间潜在的相互作用进行研究有助于其靶向治疗。目前针对ALS提出了为单个患者提供个性化反义寡核苷酸治疗的治疗理念，在此基础上，为ALS的常见致病途径寻找靶点药物已成为未来研究的重要方向，而个体化多靶点的干预治疗较单靶点标准化治疗可能更使患者受益。