新诊断2型糖尿病合并高尿酸血症患者的临床特征及肠道菌群变化

陈柔柔，李 娜，赫荣波，邹 婧，刘 青，张 颖，刘 煜

南京医科大学附属逸夫医院内分泌科，江苏 南京 211100

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是因嘌呤代谢紊乱而使尿酸生成过多和（或）排泄减少导致的一种代谢性临床综合征［1］。HUA 与2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）、代谢综合征、高血压、心血管疾病、慢性肾病、痛风等密切相关，是这些疾病发生发展的独立危险因素［2-6］。研究表明［7］尿酸水平的升高可直接或间接导致空腹血糖水平的升高，且尿酸水平可能与T2DM 的早期发病机制密切相关。糖尿病患者常伴有肾脏血流量减少，使肾小球缺氧，并使乳酸的生成增加，进而与尿酸竞争性排泄，从而导致尿酸的排泄减少。此外，糖尿病患者中多数伴有肥胖症、脂代谢障碍、胰岛素抵抗等，均会影响尿酸代谢。因此，糖尿病与HUA 可能存在共同的发病基础。

肠道微生态作为人体中最大的微生态系统，被认为是调节宿主代谢的一个重要器官，存在于人体肠道的大量微生物被称为肠道菌群。现有研究显示［8］，肠道菌群组成变化与多种疾病均具有相关性，包括HUA、糖尿病、代谢综合征、肾脏病、冠心病和肿瘤等。

本研究主要通过对不同病程的T2DM合并HUA的临床特征进行分析，并进一步分析T2DM 合并HUA的肠道菌群结果特点，探究T2DM合并HUA的发生发展是否与肠道菌群的组成改变相关，旨在为新诊断T2DM 合并HUA 的微生态治疗提供新的理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象

本研究随机纳入2019年7月—2020年7月在南京医科大学附属逸夫医院内分泌科及健康管理中心就诊的18～80 岁患者，包括单纯新诊断T2DM 患者103例和T2DM合并HUA患者98例。T2DM合并HUA 患者中，新诊断的患者29 例，病程1～5 年的患者27例，病程>5年的患者42例。从新诊断T2DM合并HUA组及单纯新诊断T2DM组中各选取年龄及性别匹配的患者，纳入9例新诊断T2DM合并HUA的患者（DMUA组），8例单纯新诊断T2DM的患者（T2DM组），并同期收集年龄及性别匹配的8 例HUA 患者（HUA组）及8例健康志愿者（Control 组），分别采集粪便标本。并同时收集所有研究对象的一般资料、实验室检查结果。本研究方案经南京医科大学附属逸夫医院伦理委员会批准（No2017⁃SR⁃001.S2）。

入组标准：①单纯HUA患者：年龄18～80岁；参照《2013高尿酸血症和痛风治疗的中国专家共识》，正常饮食状态的非同日2次的空腹水平所检测出的血尿酸值：男性血尿酸的水平≥420 μmol/L，女性血尿酸的水平≥360 μmol/L；未用降尿酸药物。②单纯新诊断T2DM患者：年龄18～80岁；参照《中国2型糖尿病防治指南2017 年版》的糖尿病诊断标准；新诊断的2 型糖尿病患者，即12 个月内诊断为2 型糖尿病患者（WHO 标准，1999 年）；未用任何药物，包括降糖及调脂药物等。③新诊断T2DM 合并HUA 患者：同时满足①和②的入组标准。④T2DM 合并HUA 患者：年龄18～80 岁；参照《中国2型糖尿病防治指南2017年版》的糖尿病诊断标准；正常饮食状态的非同日2次的空腹水平所检测出的血尿酸值：2次的血清尿酸水平男性≥420 μmol/L，女性≥360 μmol/L。T2DM 病程<1 年的患者无用药史；病史1～5 年的患者仅单用二甲双胍；病史>5年的患者为单用二甲双胍或二甲双胍联合基础胰岛素，未用降尿酸、调脂药物及利尿剂等。

健康对照组：年龄18～80 岁；血糖正常，无糖尿病家族史；正常嘌呤饮食状态下，尿酸正常；近3 个月内未服用微生态制剂或抗生素；近1 个月内无腹泻及其他胃肠道的疾病史，无胃肠道手术史；无长期服用药物史。

排除标准：近3 个月内服用微生态制剂或抗生素者；有腹泻及其他胃肠道的疾病史；长期酗酒、大量进食动物内脏及海产品等习惯的患者；严重心脑、肝肾功能障碍；1 型或其他类型糖尿病；长期使用的药物不符合入组标准。

1.2 方法

1.2.1 一般资料及样本收集

患者临床信息采集主要通过随访问卷、医院信息系统等多种途径获取患者的基本信息、临床检验结果和临床特征。采集研究对象清晨排便后的新鲜粪便标本约5 g，置于密闭无菌粪便采集盒内，分别编号。所有粪便采集盒的管壁及管帽上均标注患者的姓名、编码等基本信息（油性笔做好标记），并于30 min 内迅速储存于-80 ℃低温冰箱中，避免反复冻溶。

1.2.2 粪便16S rRNA基因测序

粪便样本基因组DNA的提取采用SDS方法，并进一步使用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 纯度及浓度，随后将适量的样品放置在离心管中，用无菌水稀释样品至1 ng/μL。选择所需进行测序的区域，采用带Barcode 特异性引物，16S V3⁃V4 区的引物为341F：CCTAYGGGRBGCASCAG；806R：GGAC⁃TACNNGGGTATCT AAT，进一步对细菌的16S rD⁃NA V3⁃V4区进行PCR扩增。根据PCR 产物浓度进一步进行等浓度的混样，并充分混合均匀，选取1×TAE 浓度2%琼脂糖胶电泳进行纯化PCR 的产物，主带大小选择在450～550 bp之间的序列，并予割胶回收目标条带。文库的构建采用美国Illumina 公司的TruSeq DNA PCR⁃Free Library Preparation Kit 建库试剂盒。经过Qubit 的定量及文库检测后，将构建好的符合后续测序要求的文库用NovaSeq6000进一步行上机测序。测序所获得的信息通过优化序列区分样本后进行OTU聚类和物种的分类分析。

1.2.3 OTU聚类和物种分类分析

α多样性分析：主要用于分析组内微生物群落的多样性［9］。本研究采用了chao1 指数、PD_whole_tree指数、goods_coverage指数和ACE指数进行统计。

β多样性分析：基于Weighted Unifrac 距离以及Unweighted Unifrac 距离可进行PCoA（Principal Coordinates Analysis）分析［10］，选择贡献率最大的主坐标的组合作图后进行展示。若样本距离越接近，则表示物种的组成结构越相似。

OTU差异显著性分析：LDA EffectSize（LEfSe）作为发现和解释高维度的生物标识分析工具之一［11］，可在组与组间寻找出组间的差异显著物种，本研究用LDA值柱状分布图及进化分支图来显示。

1.3 统计学方法

采用SPSS23.0 的统计学软件对本实验的数据进行统计分析。对正态分布计量资料的数据采用均数±标准差（）描述，两组间比较用独立t检验计算，两组以上用方差分析，对于方差不齐的数据采用Wilcoxon 秩和检验，组间两两比较采用Tukey⁃HSD 检验。通过Qimme 软件分析Beta 多样性。分组样品的物种组成、群落结构进行差异显著性检验采用的是T⁃test、LEfSe、MetaStat 等统计学分析方法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征比较

比较98 例T2DM 合并HUA 患者不同糖尿病病程（病程<1 年、1～5 年和>5 年）的临床特征，结果显示，不同病程患者的年龄、低密度脂蛋白、并发症发生率差异有统计学意义（P<0.05）。新诊断T2DM合并HUA 组（病程<1 年）比病程大于5 年组的低密度脂蛋白显著升高（P<0.05），年龄及并发症发病率显著降低（P<0.05，表1）。

表1 不同病程T2DM合并HUA的一般情况及临床资料比较分析Table 1 General clinical data of patients with T2DM complicated with HUA in different stages（n=98）

比较新诊断T2DM 合并HUA 与单纯新诊断T2DM患者的临床特征，结果显示新诊断T2DM合并HUA 组的糖化血红蛋白水平显著降低（P<0.05），而总胆固醇、甘油三酯、胰岛素、C 肽水平、血清尿酸、空腹葡萄糖、动脉硬化指数及脂肪肝发生率显著升高（P<0.05，表2）。

表2 新诊断T2DM合并HUA与单纯新诊断T2DM的比较分析Table 2 Comparison of newly diagnosed T2DM patients with HUA and newly diagnosed T2DM patients

2.2 DMUA组与T2DM组、HUA组及Control组的肠道菌群分析

2.2.1 临床资料比较

4组研究对象的年龄、性别、体重指数（BMI）、转氨酶无明显差异（P>0.05）。DMUA 组与T2DM 组、HUA 组及Control 组相比，高密度脂蛋白降低，甘油三酯显著增高（P<0.05）。DMUA 组与T2DM 组、HUA 组相比，其动脉硬化指数亦明显升高（P<0.05，表3）。

表3 研究对象的一般情况及临床资料比较Table 3 General clinical data of patients

2.2.2 基于OTU的韦恩图

4 组样本共同存在的OTU 有318 个，而特有的OTU中，T2DM为38个，HUA为33个，DMUA为32个。在4 组样本中大部分的菌落是相似的，但又同时存在各自特有的差异性菌落（图1）。

图1 OTU的韦恩图Figure 1 Venn diagram of OTU

2.2.3 α多样性分析

图2 所示的是描述组内样本的多样性曲线，即稀释曲线（rarefaction curve），该曲线直接反映出所测序的数据量的合理性，并间接反映出其样本物种的丰富度，曲线趋于平坦时，表示所测序的数据量渐进合理。4组粪便样本细菌稀释曲线末端相对平坦，检测样本可满足后续实验。

图2 OTU指数稀释曲线Figure 2 OTU exponential dilution curve

α多样性分析结果显示，α多样性指数中chao1指数、ACE 指数、PD_whole_tree 指数及goods_coverage指数比较，DMUA组、T2DM组及HUA组与Control组相比均显著降低（P<0.01，图3），但DMUA 组与T2DM组及HUA组相比，α多样性指数均无明显差异。

图3 各组肠道菌群α多样性指数箱式图Figure 3 Box diagram of α diversity index of intestinal flora in each group

2.2.4 β多样性分析

基于Unweighted Unifrac 距离分析显示，DMUA组较Control 组和HUA组菌群结构存在显著差异（表4）；另外，基于Weighted Unifrac距离分析结果表明，DMUA组较T2DM组（P=0.002 4）和HUA组（P=0.01）均有明显差异（表4）。图4 的PCoA 结果表明，4组样本的离散较好，推断组间菌群结构存在显著差异。

图4 基于weight unifrac距离的PCoAFigure 4 PCoA based on weight Unifrac distance

表4 用Weighted Unifrac 及Unweighted Unifrac 分析β多样性差异Table 4 Weighted Unifrac and Unweighted Unifrac were used to analyze β diversity（P值）

2.2.5 肠道菌群物种组成分析

图5A 显示的是各组研究对象在门分类水平的相对分布柱状图。各组丰度排名前4 的物种，Con⁃trol组是厚壁菌门（68.25%）、拟杆菌门（22.89%）、变形杆菌门（4.65%）、放线菌门（3.26%），T2DM组是厚壁菌门（49.98%）、拟杆菌门（38.58%）、变形杆菌门（7.68%）、放线菌门（3.30%），HUA 组是拟杆菌门（46.81%）、厚壁菌门（33.28%）、变形杆菌门（12.99%）、梭杆菌门（4.74%），DMUA 组是厚壁菌门（53.55%）、拟杆菌门（29.46%）、变形杆菌门（13.01%）、放线菌门（2.75%）。其中，DMUA 组与HUA 组相比，厚壁菌门比例显著升高，而拟杆菌门比例显著下降。

在属水平上（图5B），丰度排名前4的物种，Control组是劳特氏菌属（13.83%）、拟杆菌属（12.42%）、普拉梭菌属（10.85%）、巨单胞菌属（7.62%），T2DM 组是拟杆菌属（27.26%）、普拉梭菌属（14.16%）、巨单胞菌属（6.72%）、劳特氏菌属（4.36%），HUA 组是拟杆菌属（37.16%）、普拉梭菌属（13.36%）、克雷伯氏菌属（8.46%）、Parabacteroides（5.59%），DMUA 组是拟杆菌属（20.62%）、巨单胞菌属（17.85%）、普拉梭菌属（10.40%）、肠杆菌科未确定菌属（9.92%）。其中，DMUA组与HUA组相比，巨单胞菌属（P=0.039 9）比例升高，而拟杆菌属（P=0.003 06）和劳特氏菌属（P=0.002 46）比例降低。

图5 门水平和属水平的相对分布情况Figure 5 Relative distribution of phylum level and genus level

2.2.6 各组间OTU差异显著性分析

DMUA 组与HUA 组相比（图6 A、B），普雷沃氏菌科（f_Prevotellaceae）和巨单胞菌属（g_Megamo⁃nas）显著增加，而拟杆菌门（p_Bacteroidetes）、拟杆菌纲（c_Bacteroidia）、拟杆菌目（o_Bacteroidales）、拟杆菌科（f_Bacteroidaceae）、拟杆菌属（g_Bacteroi⁃des）、坦纳菌科（f_tannerellaceae）和g_Parabacteroi⁃des明显减少。

DMUA 组与Control 组相比（图6 C、D），梭菌纲（c_Clostridia）、梭菌目（o_Clostridiales）、消化链球菌科（f_Peptostreptococcaceae）、g_Romboutsia 显著减少。

图6 DMUA组与Control组、HUA组的LDA值分布柱状图和进化分支图Figure 6 Histogram of LDA value distribution and evolutionary branching of DMUA group，Control group and HUA group

3 讨论

本研究的一般临床资料对比中显示新诊断T2DM 合并HUA 更容易合并脂代谢异常，并容易导致内脏脂肪堆积。现有多项研究均证实肠道菌群与糖尿病、高尿酸血症及脂代谢存在相关性［7-8，12-14］，所以我们推断肠道菌群与新诊断T2DM 合并HUA的发生发展及其脂代谢异常可能存在一定的关系。在进一步的肠道菌群分析中，DMUA组与HUA组相比，厚壁菌门、普雷沃氏菌科和巨单胞菌属显著增加，而拟杆菌（门、纲、目、科、属）、坦纳菌科和Parabacteroides 菌属明显减少。DMUA 组与Control组相比，其梭菌纲、梭菌目、消化链球菌科、Rombout⁃sia菌属显著减少。

Shao 等［15］的有关痛风的粪便菌群及其代谢组学结果显示，痛风患者的拟杆菌属等一些条件致病菌的数量明显增加，且与尿酸排泄、嘌呤代谢及炎症反应相关的代谢产物也发生明显改变。痛风患者肠道菌群中存在的拟杆菌和梭状芽胞杆菌的变化，提示了肠道中主导菌群可能对原发性痛风的发生发展存在重要作用［16］。此外，拟杆菌门、变形杆菌门和梭状芽孢杆菌类还被证实与胰岛素抵抗及糖尿病相关［17］。在本研究中，DMUA 组的拟杆菌较HUA 组显著减少，同时其梭菌纲、梭菌目比Control组明显减少，因拟杆菌及梭菌与尿酸代谢及胰岛素抵抗均存在相关性，其丰度的变化有可能进一步促进新诊断T2DM合并HUA的发生与发展。

据文献报道［18-21］，劳特氏菌属产生的代谢产物可能同时影响血糖及尿酸水平。在本研究中，DMUA 组与HUA 组在属水平相比较，其劳特氏菌属比例显著降低，提示劳特氏菌属丰度的减少可能是参与新诊断T2DM 合并HUA 发生发展的相关因素。

因代谢性疾病发病早期与厚壁菌门、梭菌纲和梭菌目的丰度变化存在相关性［22］。在本研究中，DMUA 组与Control 组的肠道菌群对比中，其厚壁菌门减少，梭菌纲、梭菌目显著减少，故推测DMUA组与Control 组之间存在的差异菌丰度的变化可能是导致新诊断T2DM 合并HUA 的发病因素之一。在使用LEFSe 方法的分析中未发现DMUA 组与T2DM组存在明显差异菌，这可能与两组患者的病程均较短有关，因本次试验样本量较少，后续可扩大样本量进一步分析。

临床资料对比中，新诊断T2DM 合并HUA 组比病程>5年组的低密度脂蛋白显著升高（P=0.02），因在入组标准的用药史中病史1～5年的患者单用二甲双胍及病史>5 年的患者为单用二甲双胍或二甲双胍联合基础胰岛素，考虑二甲双胍对脂代谢存在一定的影响，且同时会受到年龄及性别等混杂因素的影响，后续可进一步增加对照组及扩大样本量对相关指标进一步分析。

综上，DMUA 组所存在的肠道菌群丰度及组成的差异可能是新诊断T2DM 合并HUA 的发生及发展的重要影响因素之一。但由于肠道菌群复杂多样，影响菌群因素众多，本研究存在一定的局限性，仍需进一步扩大实验样本数量，可对影响的相关因素进一步细化，探索肠道菌群与新诊断T2DM 合并HUA之间的深层次关系，后续可对差异菌行代谢组学分析进一步了解细胞通路、能量传递等代谢途径是否产生变化，以期探索新诊断T2DM合并HUA的诊断、预防及治疗的方法。