维生素D受体核定位信号的鉴定

马泽萌，陈允梓

南京医科大学基础医学院免疫学系，江苏 南京 211166

维生素D（vitamin D，VD）是一种脂溶性维生素［1］，不仅调节钙磷代谢和骨健康，在免疫系统［2］、神经系统和代谢系统中也发挥重要的调节作用，它通过与维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）结合而发挥作用［3-4］。VD 与VDR 的结合能激活VDR 发生核转位，在细胞核内发挥转录因子功能，启动下游基因的表达，从而参与细胞的生长分化与免疫应答的调控［5-7］。

核定位信号（nuclear localization sequence，NLS）是蛋白质实现核转位的重要结构域，通常由4～8 个氨基酸组成的短序列，含有Pro、Lys和Arg。有研究表明，VD 在细胞内主要通过激活VDR 发生核转位发挥转录因子功能［8-9］，VDR核定位信号可能位于两个锌指结构之间，其氨基酸序列与核定位相关［10-11］，但缺乏精确定位和实验鉴定。研究表明，VDR在胞质中也发挥功能，它能与IKKβ相互作用并抑制NF⁃κB的激活［12］。因此，VDR的生物学功能与其细胞定位密切相关，确定VDR 的NLS 对深入了解VDR 信号具有重要意义。本研究采用软件分析预测NLS并进行点突变验证，确定了VDR的NLS序列及其对VDR 活性的影响，为VD 及VDR 的入核信号通路的调控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

VD 由美国芝加哥大学Yanchun Li 教授赠送。胰酶、胎牛血清（Gibco 公司，美国），PVDF 膜（Bio⁃Rad公司，美国），Triton X⁃100、Tris、NP40、甘油和吐温20（合肥Biosharp公司），NaCl、KCl、EDTA（上海凌峰化学试剂有限公司），胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒（上海Omega Bio⁃tek公司），HA抗体（Abmart公司，美国），Tublin 抗体、VDR 抗体（Santa Cruz 公司，美国），HRP 标记抗兔IgG 抗体、HRP 标记抗鼠IgG抗体（Jackson Immune Research 公司，美国），LaminB抗体、Tris⁃HCl pH 8.8、Tris⁃HCl pH 6.8、抗荧光猝灭剂、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（上海碧云天技术有限公司），组织固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司），Poly⁃JET（济南Signa⁃Gen），GAPDH抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），所有引物由南京金斯瑞公司合成。SYBR Green QPCR 试剂盒、逆转录酶试剂盒、点突变试剂盒（Mut Express ⅡFast Mutagenesis Kit V2）（南京诺唯赞生物科技有限公司）。

pCMV⁃HA⁃VDR 质粒由本实验室提供［6］，HEK293T和HeLa细胞来自美国ATCC。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计

对质粒引入单碱基或多碱基的定点突变，引物设计如表1，采用点突变试剂盒在质粒pCMV⁃HA⁃VDR 上构建了突变体HA⁃VDR（R49W/R50G）、HA⁃VDR（K53Q/R54G/K55EP）、HA⁃VDR（R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E）。

表1 VDR基因点突变引物Table 1 VDR gene point mutation primers

1.2.2 实时荧光定量PCR分析

在质粒转染及VD 刺激后，收集HeLa 细胞，采用TRIzol 试剂提取总RNA，并根据逆转录酶试剂盒说明书将其逆转录为cDNA，然后采用SYBR Green QPCR 试剂盒，在StepOnePlus（Applied Biosystems）上分析cDNA，进行靶基因的扩增（表2）。

表2 实时荧光定量PCR引物Table 2 Real⁃time fluorescent quantitative PCR primers

1.2.3 VDR的亚细胞定位分析

HEK293T 细胞进行质粒转染，经VD 处理后收集细胞。采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒分别获得胞质和胞核组分，点样10%聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）进行电泳分离，再经湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，进行5%BSA室温封闭1 h。一 抗分别采用VDR、Tubulin和Lamin B 抗体，4 ℃孵育过夜，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗免多聚抗体，室温孵育1 h。最后采用ECL 化学发光法检测，在蛋白分析仪拍摄下进行结果分析。

1.2.4 免疫荧光分析

细胞样品采用4%多聚甲醛固定，室温15 min，PBS清洗2遍，再用0.02%NP⁃40处理15 min。然后用QuickBlockTM免疫染色封闭液封闭15 min，进行一抗HA 抗体孵育，4 ℃过夜。次日，PBS（含0.5%Tri⁃tion X⁃100）清洗后，加入荧光标记的二抗室温孵育1 h。最后复染DAPI，细胞样品进行荧光显微镜的图像采集并分析。

1.3 统计学方法

实验数据用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计学分析，各组数据用均数±标准差（x ± s）表示，多组定量资料比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）检验，多组间数据两两比较采用LSD 法。两组定量数据比较用t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VDR核定位信号的预测

为了初步确定VDR的核定位信号位置，借助在线预测网站对VDR 氨基酸全序列进行了分析（http：//nls ⁃ mapper.iab.keio.ac.jp/cgi ⁃ bin/NLS_Map⁃per_form.cgi），预测结果显示核定位信号序列为49RRSMKRKALFLT61（图1A）。对不同物种来源的VDR进行序列比对，发现预测的核定位信号序列具有很好的保守性（图1B）。

图1 预测VDR核定位信号Figure 1 Predicting the nuclear localization signal of VDR

2.2 VDR突变体的构建

根据预测的结果和文献报道［10］，针对VDR核定位序列中的保守氨基酸精氨酸（R）和赖氨酸（K）进行点突变设计，采用点突变试剂盒（Mut Express ⅡFast Mutagenesis Kit V2）以质粒pCMV⁃HA⁃VDR 为模板，构建了一系列突变体（R49W/R50G、K53Q/R54G/K55E 和R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E），通过Vector NTI 软件对测序结果进行分析，结果显示VDR突变体成功引入突变点（图2）。

图2 构建VDR点突变Figure 2 Constructing VDR point mutations

2.3 VDR点突变抑制其入核能力

为了验证点突变是否对VDR核定位产生影响，将VDR 突变体（HA⁃VDR、HA⁃VDR⁃R49W/R50G、HA⁃VDR⁃K53Q/R54G/K55E、HA⁃VDR⁃R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E）转染HEK 293T 细胞进行表达。在VD 100 nmol/L处理前后，分别获取细胞样品进行核质分离，并采用Western blot 分析，其中Tubulin为胞质内参，Lamin B为胞核内参。结果表明，VD处理能诱导野生型VDR 转位细胞核内（图3A），而VDR突变体VDR（R49W/R50G），VDR（K53Q/R54G/K55E）和VDR（R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E）的表达主要停留在胞质中，不能被VD 诱导转位入细胞核（图3B～D）。由此可见，在预测的NLS里这些保守位点的突变抑制了VDR进入细胞核，初步确定它们是VDR入核的关键位点。

图3 VDR的点突变抑制其核定位Figure 3 VDR point mutations inhibit the transfer of VDR to the nucleus

接着，采用免疫荧光法直接观察VDR点突变对其空间分布的影响。在HeLa细胞中转染VDR及其突变体载体，观察这些蛋白的表达在VD 刺激前后在细胞空间上的分布差异，以DAPI 标记细胞核，红色荧光标记HA⁃tag 指示VDR 及变体的所在位置。如图4 结果所示，在VD 刺激下，野生型HA⁃VDR 发生明显转位进入细胞核，而VDR 突变体在VD 刺激前后，细胞内的空间分布并未发生明显变化，与上述Western blot 结果一致，表明这些点突变位点是VDR核定位的关键位点。

图4 VDR点突变影响VDR在细胞内的分布Figure 4 VDR point mutations affect the spatial distribution of VDR in cells

2.4 VDR点突变减弱了对下游基因表达的调控

VD 的生物学功能主要由VDR 下游基因实现。Cyp24a1、Atp2b1 是VDR 调控的下游基因［13-14］，而Cyp27A 不受VDR 调控作为阴性对照。在HEK 293T 细胞里瞬时表达HA⁃VDR 及点突变体，采用100 nmol/L VD 处理，收集细胞样品进行qPCR 检测。如图5所示，在VDR 表达的细胞里，VD 可以有效诱导Cyp24a1 mRNA、Atp2b1 mRNA 水平上调；而在VDR 点突变表达的细胞中，VD 诱导Cyp24a1 mRNA、Atp2b1 mRNA 表达的能力显著降低，说明VDR 的点突变能削弱了VD 的生物学功能，不能有效响应VD信号启动下游基因的转录。

图5 VDR的点突变影响了VDR对下游基因的转录Figure 5 VDR point mutations affect the transcription of downstream genes by VDR

3 讨论

VDR的活性受VD调控，在一些疾病如癌症、神经系统疾病、免疫性疾病的研究中已成为预防、诊断和治疗的重要靶点分子［15-19］。VD 与VDR 结合能激活VDR入核发挥转录因子功能，确定其NLS有助于进一步了解VDR在细胞核和细胞质中的不同功能，为研究相关疾病提供参考依据。

根据在线网站预测分析VDR 的核定位信号位置，提示VDR的NLS为49RRSMKRKALFLT61，并且通过序列比对显示在不同种属VDR 序列里该NLS 具有很好的保守性。根据NLS保守性分析，针对49/50位、53/54/55位、49/50/53/54/55位的保守氨基酸进行突变，通过Western blot 和免疫荧光等方法进行检测，结果显示：当VD 刺激后，野生型VDR 能快速入核；而VDR 的NLS 突变都能有效抑制VDR 入核，证明了这些氨基酸位点参与调控VDR 的入核。据文献报道，VD 与VDR 结合能启动生物反应，启动下游基因如CYP24A1、ATP2B1 等的转录。通过qPCR检测这些下游基因，结果表明突变体VDR明显抑制了CYP24A1、ATP2B1 的mRNA 表达，确定了这5 个位点是VDR 入核并发挥转录调节作用的关键位点。基于这些VDR点突变体不能入核的性质，提示这些点突变体可作为研究胞质VDR功能的新工具，应用于VDR的相关研究［20］。

通常，精氨酸（R）可以被甲基化修饰，赖氨酸（K）可以被泛素化修饰，而这些蛋白质的后加工修饰形式也可以调控蛋白质的核定位行为，例如：Laims 蛋白能发生泛素化调节其核定位［21］，PRMT1甲基化酶能使p14ARF蛋白发生甲基化修饰调节该蛋白的核定位［22］。因此，对于VDR点突变体不能入核的现象，推测还存在另一个可能：当精氨酸和赖氨酸位点进行点突变后，可能抑制了VDR的泛素化或甲基化的后加工形式，从而影响VDR的入核行为。是否VDR的这些位点会发生后加工修饰参与VDR核定位的调节呢？这也是一个值得探究的问题。

总之，本研究通过预测分析，点突变体的构建，结合亚细胞定位分析和qPCR 等方法，确定了VDR的核定位信号为49RRSMKRKALFLT61，并且证明了这5 个位点（49/50/53/54/55）的突变能够影VD/VDR信号的生物学活性，这一发现为探索VDR 在细胞质和细胞核中的作用提供研究平台，为探讨VD/VDR 相关疾病的预防、诊断和治疗提供了一定的理论基础。