STAT3通过血小板反应蛋白4诱导足细胞凋亡及炎症反应

庄一波，杨 勇，宁晶晶

常州市第一人民医院儿科，江苏 常州 213004

糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病的一种进行性微血管并发症，由肾小球毛细血管损伤引起。其病理表现为持续性蛋白尿、肾小球滤过率降低、动脉血压升高等［1］。迄今为止，DKD已成为糖尿病患者预期寿命缩短的主要原因。由于糖尿病发病率的增加，DKD的年发病率在过去10年中增加了1 倍以上。目前DKD 约占终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）病例的50%［2］。DKD的发病机制十分复杂，尚未明确。一般认为足细胞损伤、减少以及蛋白尿是DKD 的主要病理因素［3］。足细胞是肾小球的先天细胞之一，从根本上充当肾小球滤过膜的最后一道屏障。多种原因引起的足细胞损伤使肾小球滤过膜的通透性增加，导致蛋白尿，加速肾脏疾病的进展［4］。血小板反应蛋白（thrombospondins，TSP）是一组多域糖蛋白，存在于胚胎的细胞外基质中。它们通过与受体分子结合而负责细胞⁃细胞相互作用和细胞⁃基质相互作用［5］。TSP有5个家族成员，其中TSP⁃4是一种细胞外钙结合蛋白，具有调节细胞迁移、增殖、黏附和组织重塑等多种功能［6］。TSP⁃4在保护心脏中发挥重要作用，包括心肌组织重塑和心肌肥大的预防。它也是一种与癌症相关的调节剂。TSP⁃4可通过触发血管生成，可作为治疗癌症的新靶点。此外，TSP⁃4还具有调节肌腱和骨骼肌的结构和功能的作用。文献报道了TSP⁃4在加速瘢痕形成和介导局部炎症反应中的作用［7-8］。目前TSP⁃4 在DKD 中的作用机制研究较少。本研究旨在探讨TSP⁃4在高糖（high glucose，HG）诱导的足细胞损伤中的作用及其潜在机制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠足细胞系（ATCC，美国），RPMI 1640 培养基和0.25%胰蛋白酶（HyClone 公司，美国），胎牛血清（Gibco 公司，美国），TRIzol、Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司，美国）。鼠抗TSP⁃4 多克隆抗体（R&D 公司，美国），增强化学发光法（enhanced che⁃miluminescence，ECL）试剂盒、细胞计数试剂盒（cell counting kit⁃8，CCK⁃8）、5⁃乙炔基⁃2’脱氧尿嘧啶核苷（5⁃ethynyl⁃2’⁃deoxyuridine，EdU）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、Hoechst 33342试剂盒、RIPA裂解液、葡萄糖、兔抗信号转导因子和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）多克隆抗体、兔抗p⁃STAT3 多克隆抗体和抗β⁃actin 单克隆抗体等（上海碧云天生物技术公司），STAT3 激动剂Colivelin（Selleck 公司，美国），实时荧光定量聚合酶链反应（real⁃time quantitative PCR，qRT⁃PCR）试剂盒（TaKaRa公司，日本），Annexin V⁃FITC（BD Biosciences 公司，美国），EdU溶液、酶标仪（Thermo Fisher Scientific 公司，美国），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）使用试剂盒（南京建成生物工程研究所），2’，7’⁃二氯荧光素二乙酸酯（2’，7’⁃dichloro⁃fluorescin diacetate，DCFH⁃DA）（Sigma 公司，美国），电泳仪和转膜仪（北京六一公司），凝胶成像系统（Bio⁃Rad 公司，美国），双荧光素酶报告系统（Pro⁃mega 公司，美国），高速低温离心机器（Eppendrof 公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染

小鼠足细胞系在RPMI164037℃培养，以30mmol/L葡萄糖刺激作为HG 组，5 mmol/L 葡萄糖诱导作为阴性对照组。使用Lipofectamine 2000 常规进行细胞转染。接种在24 孔板中的细胞生长至30%～50%。6 h更换新鲜培养基。48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.2.2 定量逆转录聚合酶链反应

使用TRIzol 收集总RNA。使用商业试剂盒从总RNA 的逆转录中获得cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix将其用作qRT⁃PCR的模板。95 ℃预变性30 s，95 ℃10 s 变性，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s循环40个循环。GAPDH为内参，相对水平采用2-ΔΔCT法计算。GAPDH 的序列为5′⁃AGGTCGGTGT⁃GAACGGATTTG⁃3′（正向）和5′⁃GGGGTCGTTGATG⁃GCAACA⁃3′（反向），TSP⁃4的序列为5′⁃ACCGACAG⁃TAGAGATGGTCTTCC⁃3′（正向）和5′⁃CGTCACAT⁃CTGAAGCCAGGAGA⁃3′（反向）。

1.2.3 蛋白质印迹法

细胞裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，使用BCA法测定蛋白质浓度后，制备蛋白质样品用于SDS⁃PAGE（每泳道30 μg）并转移到PVDF 膜上。在特定条件下阻断膜上的非特异性抗原后，用一抗［抗TSP⁃4（1∶2 000）、抗STAT3（1∶2 000）和抗p⁃STAT3（1∶2 000）］和二抗（1∶5 000）。使用ECL方法检测蛋白质信号。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（enzyme⁃linked immuno⁃sorbent assay，ELISA）

收集细胞上清液，5 000 r/min、4 ℃离心10 min。按照推荐使用ELISA 试剂盒检测促炎因子的相对水平。

1.2.5 流式细胞术

PBS洗涤后，离心细胞并重悬。在黑暗中用10 μL Annexin V⁃FITC 诱导细胞，然后1 000 r/min 离心5 min。重悬的沉淀剂在4 ℃避光下用5 μL PI 进一步诱导。使用流式细胞术在30 min 内检查凋亡细胞。通过PI染色类似地检查细胞周期分布。

1.2.6 CCK⁃8检测

细胞接种于96孔板中，接种量为3×103个/孔。空白组只填充培养基。在指定时间点，每孔加入10 μL CCK⁃8溶液，培养4 h。通过酶标仪测量450 nm处的光密度值。

1.2.7 EdU检测

将细胞以1×106个/孔接种于24孔板中，培养过夜。使用EdU溶液染色，Hoechst 33342用于在黑暗中染色细胞核。捕获了EdU 染色的细胞（红色）、Hoechst 33342 染色的细胞核（蓝色）以及合在一起的细胞图像。

在妊娠前半期，支持胎儿脑神经发育的甲状腺激素主要来自母体。妊娠期患有甲状腺疾病的患者也要摄取足够的碘，食用加碘食盐是最好的方法。患有自身免疫甲状腺炎和甲状腺功能减退的妊娠妇女，还要定期监测甲状腺功能。

1.2.8 MDA、SOD和CAT的测量

MDA、SOD和CAT的相对水平使用试剂盒按照建议进行检测。

1.2.9 活性氧（reactive oxygen species，ROS）的测量

DCFH⁃DA 方法测量细胞内ROS 水平。分别测量了485 nm 发射波长和530 nm 发射波长下的光密度。

1.2.10 染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipi⁃tation，ChIP）

2×107个细胞用1%甲醇裂解，超声处理制备200～1 000 bp 的DNA 片段。细胞裂解物与1 μg 抗IgG 或抗STAT3 一起孵育。然后在4 ℃下在20 μL蛋白A/G 免疫沉淀磁珠中诱导染色质上清液过夜。第2 天，蛋白质⁃DNA 复合物被洗脱和纯化，获得的DNA样品进行qRT⁃PCR。

1.2.11 双荧光素酶报告基因检测

将接种在96 孔板中的细胞与含有野生型或突变型TSP⁃4启动子和STAT3的小干扰RNA（small in⁃terfering⁃STAT3，si⁃STAT3）/阴性siRNA 序列（si⁃neg⁃ative control，si⁃NC）的pGL3荧光素酶报告载体共转染。双荧光素酶报告系统用于测量相对荧光素酶活性，以海肾荧光素酶活性作为内参。

1.3 统计学方法

Western blot 图像的数据提取使用Image Lab 软件。使用SPSS 22.0 进行统计分析。两组间的对比在正态性检验之后用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。所有实验重复3次。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HG诱导的足细胞中TSP⁃4的上调

检测HG 诱导0、24、48、72 h 的足细胞中TSP⁃4的表达水平。结果表明，TSP⁃4的核酸（图1A）和蛋白质水平（图1B、C）均呈时间依赖性上调，在72 h达到峰值。

图1 HG呈时间依赖性诱导足细胞中TSP⁃4的表达Figure 1 Upregulation of TSP⁃4 in HG⁃induced podocytes

2.2 干扰TSP⁃4抑制HG诱导的足细胞凋亡

足细胞凋亡是DKD 发展过程中的一个重要事件。我们发现在足细胞中，HG 降低了细胞活力和EdU 阳性细胞比例（图2A～C）。有趣的是，我们应用siRNA 干扰了TSP⁃4 后，细胞活力和EdU 阳性细胞显著高于对照组，表明干扰TSP⁃4 后促进了足细胞的增殖。流式细胞术结果表明HG刺激增加了G1期的细胞凋亡率和细胞比例，但是应用si⁃TSP 后会抑制这种情况（图2D、E）。因此，抑制TSP⁃4的表达可以阻断HG诱导的足细胞损伤。

图2 干扰TSP⁃4抑制HG诱导的足细胞凋亡Figure 2 Knockdown of TSP⁃4 inhibits HG⁃induced apoptosis in podocytes

2.3 干扰TSP⁃4可减轻HG诱导的足细胞氧化应激

氧化应激有助于DKD的恶化。为了确定TSP⁃4对HG 诱导的足细胞氧化应激的影响，我们使用DCF⁃DA 方法检测了细胞内ROS 水平。结果表明HG 诱导ROS 的表达，可被si⁃TSP⁃4 逆转（图3A）。此外，还检测了MDA、SOD 和CAT 的相对表达水平。HG 诱导的足细胞中MDA 表达升高，SOD 和CAT活性降低，与HG诱导ROS的表达变化一致，从而进一步证明HG诱导了氧化应激。但它们的水平均可通过si⁃TSP⁃4来逆转（图3B～D）。

图3 干扰TSP⁃4减轻HG诱导的足细胞氧化应激Figure 3 Knockdown of TSP⁃4 alleviates oxidative stress in HG⁃induced podocytes

2.4 干扰TSP⁃4抑制HG诱导的足细胞炎症反应

我们通过检测促炎因子的相对表达水平，进一步检查了TSP⁃4 在HG 诱导的足细胞炎症反应中的潜在作用。HG 上调足细胞中IL⁃1β、TNF⁃α和IL⁃6的表达水平，并且应用si⁃TSP⁃4 后它们的表达水平降低（图4）。因此，干扰TSP⁃4可有效抑制HG诱导的炎症反应。

2.5 STAT3激活TSP⁃4的转录

使用JASPAR 预测TSP⁃4 启动子区域中的潜在结合位点与STAT3结合（数据未显示）。STAT3是一种经典的转录因子，它通过靶向基因表达来介导基因表达。发现p⁃STAT3 在HG 诱导的足细胞中呈时间依赖性上调（图5A、B）。加入STAT3 激动剂Colivelin 后，TSP⁃4 的表达水平明显上调，抑制STAT3 的表达可显著下调TSP⁃4（图5C、D），表明STAT3可能介导TSP⁃4的转录。推测STAT3通过直接结合其启动子来激活TSP⁃4 的表达水平。通过ChIP 检测分析，证实STAT3 蛋白能够与TSP⁃4 的启动子结合（图5E）。此外，双荧光素酶报告基因检测阐明STAT3 激活了野生型TSP⁃4 的启动子，而不是突变型1（图5F、G）。故足细胞中的TSP⁃4 可以被STAT3激活。

图5 STAT3激活TSP⁃4的转录Figure 5 STAT3 activates the transcription of TSP⁃4

3 讨论

DKD的全球死亡率相对较高。更重要的是，随着发病率的逐年增加，医疗费用增多。DKD的发病机制非常复杂且不确定，涉及多种类型细胞和各种因素［9-10］。本研究发现，TSP⁃4 在HG 诱导的足细胞中显著上调，从而加剧了足细胞的凋亡和炎症反应。文献报道HG刺激导致细胞中大量产生晚期糖基化终产物（AGE），并不断积累［11］。同时，在AGE的产生过程中，线粒体会释放大量的ROS。过量的ROS 最终会导致氧化和抗氧化系统失衡，从而导致细胞受损。氧化应激可直接导致足细胞凋亡，或通过肌动蛋白重排、内皮素⁃1合成增加或微血管通透性改变等间接引起足细胞凋亡［12］。本研究结果表明，HG诱导的足细胞中ROS水平显著增加，可通过抑制TSP⁃4 的表达而降低。这表明抑制TSP⁃4 的表达发挥了抗氧化作用。

氧化应激与炎症反应密切相关，它们的协同作用引发了DKD 的恶化。全身和局部炎症反应都参与了DKD的发展。以往研究表明，DKD患者肾脏中过量的ROS会诱导炎症细胞的浸润和募集，从而进一步加速IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α和NF⁃κB等促炎因子的产生，并启动DKD的发作［13］。血浆IL⁃6和TNF⁃α也有助于DKD 的进展。它们能够提高系膜细胞的增殖率，扩大细胞外基质，重要的是通过在正反馈回路中产生ROS来增加内皮细胞通透性［14］。NF⁃κB是启动糖尿病炎症反应的主要转录因子。它在DKD患者的肾脏中上调，可以调节黏附分子和促炎因子如MCP⁃1、TNF⁃α和IL⁃6 的表达水平［15］。文献报道［16］ESRD 患者粒细胞和单核细胞中Mac⁃1（CD11b/CD18）上调与血浆MDA 含量增加以及超氧化物和过氧化氢的产生有关，表明氧化应激和炎症反应之间存在相互作用。本研究发现干扰TSP⁃4的表达可抑制HG诱导的足细胞中炎症因子水平的增加。然而，TSP⁃4的相关炎症机制尚不清楚。

STAT3位于人染色体17q21.2，通过作用于细胞表面的多肽受体发挥生物学效应［17］。它是一种参与DKD 发病机制的功能性转录因子。抑制STAT3活性可以减轻大鼠DKD 的发展［18］。本研究中，HG诱导的足细胞中STAT3的磷酸化水平显著升高，通过诱导TSP⁃4转录，从而上调了TSP⁃4的表达水平。

本研究存在一些局限性。应用HG刺激足细胞形成体外DKD模型，在未来的研究中需要一个体内DKD模型来验证发现。此外，虽然发现STAT3调节TSP⁃4 的表达，但TSP⁃4 是否负责STAT3 的功能还需要进一步验证。综上所述，在HG 诱导的足细胞中TSP⁃4 上调，这可能是由STAT3 磷酸化水平增加引起的。抑制TSP⁃4的表达对减轻HG诱导的足细胞凋亡、氧化应激和炎症反应具有保护作用。结合本研究，认为TSP⁃4是DKD的一个重要的新治疗靶点，为DKD的治疗带来了新的启发和实验依据。