干旱胁迫下外源褪黑素对小麦生长和光系统活性的影响

李春雨，陈春宇，毛浩田，张怀渝，陈洋尔

(四川农业大学 生命科学学院,四川雅安 625014)

水资源短缺是制约农业发展的全球性问题，世界范围内由干旱造成的小麦减产超过其他因素所导致的产量损失总和[1]，严重威胁着人类的粮食安全[2]。水是保证小麦正常生长发育的重要因素。我国也是全球最大的小麦生产国和消费国，每年总产量约为1.3亿t[3]。我国小麦的主产区秦岭-淮河以北一带存在不同程度的水资源短缺问题，给小麦生产造成了严重影响[4-5]。因此，探究如何提高小麦的抗旱性，充分发掘小麦的生产潜力，是植物抗逆研究的重要课题，对解决我国水资源短缺、保障我国的粮食安全及社会稳定发展具有重大意义[6-7]。

多种植物生长调节物质如甜菜碱[8-9]、水杨酸[10]及一氧化氮[11]能增强植物对干旱的耐受力，外施植物生长调节剂已成为增强作物抗旱性的重要手段之一[11]。褪黑素(melatonin)在植物抵御非生物胁迫中发挥着重要保护作用[12]，为一种天然的吲哚胺类激素，最早发现于牛的松果体[13]，随后被证实广泛存在于植物体中[14-15]。研究表明，褪黑素不仅可促进植物及其根系的生长[16-17]，也可提高植物光合效率[18]。外源褪黑素可提高干旱胁迫下植物种子的萌发率，促进根系生长，调节植物生长及光合能力[19-21]。褪黑素处理能减缓干旱胁迫对植株造成的氧化损伤，降低植物体内的活性氧(ROS)，从而增强植物抵抗环境胁迫的能力[22-23]。褪黑素还可以通过调节植物激素水平减轻干旱对植物带来的不利影响[24-26]。植物对于干旱适应机制包括感知和信号分子传递组成的复杂调节网络[27]，而褪黑素作为一种多功能信号分子，参与干旱胁迫下植物体内的信号传导，进而对增强植物抗旱性起到积极作用[28]。

值得注意的是，干旱胁迫下，植物光系统Ⅱ(PS Ⅱ)容易受损，外源褪黑素可以通过多种方式对植物PS Ⅱ进行保护[29-32]。研究发现，外源褪黑素可以在盐胁迫下维持植物D1蛋白的活性[33]；在干旱胁迫下，外源褪黑素有助于清除ROS，防止PS Ⅱ蛋白受损[28]。而相较于PS Ⅱ，光系统I(PSⅠ)在环境胁迫下通常相对稳定，但由于PSⅠ缺乏高效的修复机制，一旦受损对于植物的影响更加严重[34]。研究表明，干旱胁迫会导致植物PSⅠ受体侧抑制，进而使植物的光合效率大为降低[28]。龙舌兰幼苗在受到干旱胁迫时，光合作用的调节主要依赖于PSⅠ的热耗散和电子传递的增强[34]。干旱胁迫下，对于植物PSⅠ的保护至关重要，而目前关于外源褪黑素能否有效保护PSⅠ却鲜有报道。因此，本研究以小麦为材料，利用聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱条件，通过测定与分析小麦生长过程中的生理指标和PSⅠ的蛋白含量，以期深入探索褪黑素在干旱胁迫下对小麦生长和光PSⅠ的影响，为提高小麦抗旱能力提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

褪黑素(melatonin)购自Sigma试剂公司。精选颗粒饱满的小麦CN19种子，用1%的次氯酸钠(NaClO)溶液消毒10 min后用蒸馏水洗净，20 ℃黑暗条件下蒸馏水浸种24 h，发芽盒内 20 ℃暗发芽48 h。挑选芽长约1 cm幼芽移植于石英砂盆栽中，每盆5株，置于人工气候室中(光照250 μmol photons·m-2·s-1，光暗周期为 16 h/8 h，温度为22 ± 1 ℃，相对湿度70%)。用1/2 Hoagland培养液和相应浓度的褪黑素将材料预处理3 d后培养至三叶期，选取长势一致、健康的植株进行干旱胁迫处理，具体设置如表1，每处理设置3个重复，干旱胁迫48 h后取植株第二叶测定其光合等生理指标。

表1 小麦褪黑素及干旱胁迫处理方式

1.2 测定指标与方法

1.2.1 叶片相对含水量和植株地上部生物量测定

采用Tambussi等[35]的方法测定小麦叶片相对含水量(RWC)和植株地上部生物量。每重复随机挑选6株小麦幼苗，沿根轴处剪开根及茎叶，取茎叶称量鲜重作为植株地上部生物量。以下指标测定取样均为三叶期小麦幼苗的第二叶。称取叶片鲜重(FW)后，将叶片置于蒸馏水2 h后称量叶片饱和重(TW)，再将叶片烘干至恒重称量叶片干重(DW)。RWC =(FW - DW)/(TW - DW)× 100%。

1.2.2 叶绿素含量、叶绿素a/b、类胡萝卜素和花青素含量测定

按照舒 展等[36]的方法，用打孔器取1 cm2叶片，80%丙酮浸提，用分光光度计(Hitachi-U2000，Tokyo，Japan)测定A645及A663值，按Arnon等[37]方法计算提取液的叶绿素浓度。参照Dashek[38]的方法测定类胡萝卜素含量。花青素含量的测定参考Pietrini等[39]的方法。

1.2.3 气体交换参数测定

采用GFS-3000便携式光合仪测定叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和胞间CO2浓度(Ci)。测定光照强度为700 μmol·m-2·s-1，CO2浓度为400 μmol·mol-1，温度为25 ℃，每组处理重复5～10次[39]。

1.2.4 叶绿素荧光参数和P700参数测定

采用Ohad等[40]的方法测定叶绿素荧光参数，参照Klughamer和Schreiber[41]的方法测定P700参数。小麦植株暗适应30 min，测定暗适应初始荧光Fo、最大荧光Fm、远红光适应下的最大P700改变量Pm、光化光下的最大P700改变量Pm'和光化光下的还原态P700总量P700 red。按公式计算:PS Ⅱ最大光化学效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，PSⅠ由供体侧限制引起的非光化学能量耗散的量子产量ΦND= 1 - P700 red，PSⅠ由受体侧限制引起的非光化学能量耗散的量子产量ΦNA=(Pm-Pm')/Pm，PSⅠ的实际光能转换效率ΦPSI=1-ΦND-ΦNA。各参数均重复测定3次，取平均值。

1.2.5 蛋白免疫印迹分析

根据Chen等[42]的方法，于暗光中提取小麦叶片的类囊体膜蛋白，采用15%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离类囊体蛋白，将凝胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，将转移后的PVDF膜进行封闭、一抗(PsaD、Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca4)孵育、二抗(辣根过氧化酶标记)孵育，孵育结束后采用荧光检测系统测定免疫印迹信号。使用Quantity One软件定量分析类囊体蛋白含量。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件处理数据，并用SPSS 20.0软件统计分析。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对干旱胁迫下小麦叶片相对含水量和植株地上部生物量的影响

干旱胁迫下，小麦叶片严重失水萎蔫且生长受到严重抑制(图1)。干旱胁迫导致了小麦叶片相对含水量下降(图2)。干旱胁迫下，5、25及100 μmol·L-1褪黑素预处理后小麦叶片相对含水量较D处理分别增加17.52%、24.62%和 15.62%，变化均显著，表明三种浓度的褪黑素预处理均可明显减缓干旱胁迫下小麦叶片相对含水量的下降，其中以25 μmol·L-1褪黑素预处理的缓解效果最明显。

图1 褪黑素对干旱胁迫下小麦表型的影响

图柱上不同小写字母表示处理间在0.05水平有显著性差异。下同。

与CK相比，干旱胁迫导致小麦地上部生物量显著下降。干旱胁迫下，5、25及100 μmol·L-1褪黑素预处理的地上部生物量较D处理分别增加20.47%、58.27%和48.82%。以上结果说明褪黑素预处理能够提高干旱胁迫下小麦抗失水能力，有效缓解干旱胁迫对小麦生长的抑制作用，促进小麦生长，其中以25 μmol·L-1褪黑素预处理效果最佳。

2.2 褪黑素对干旱胁迫下小麦叶片三种色素含量的影响

干旱胁迫使小麦叶片叶绿素含量显著低于CK(图3A)。干旱胁迫下，5 、25及100 μmol·L-1褪黑素预处理的小麦叶片叶绿素含量较D处理均显著提高，增幅分别为8.11%、 22.63%和20.14%，但褪黑素预处理对叶绿素a/b值无显著影响(图3B)；5、25及100 μmol·L-1褪黑素预处理也显著提高了小麦叶片类胡萝卜素和花青素的含量，其中类胡萝卜素含量较D处理分别增加11.00%、16.17%和26.25% (图3C)，花青素含量分别相应增加26.86%、52.30%和37.10%(图3D)。这说明褪黑素能够使干旱胁迫下小麦叶片光合色素含量保持较高的水平，有利于叶片光合作用，其中25 μmol·L-1褪黑素预处理效果最佳。

图3 褪黑素对干旱胁迫下小麦叶绿素、叶绿素a/b、类胡萝卜素和花青素的影响

2.3 褪黑素对干旱胁迫下小麦叶片气体交换参数的影响

在正常条件下，不同浓度的褪黑素处理对小麦叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)均无明显影响(图4)。干旱胁迫导致Pn、Tr、Gs、Ci均呈下降趋势(图4A、B、C、D)。干旱胁迫下，5 、25及100 μmol·L-1褪黑素预处理的小麦叶片Pn较D处理分别增加了44.13%、122.46%和54.94%，Gs分别增加16.21%、157.19%和33.58%，Ci分别增加了5.37%、30.18%和17.01%(图4B)，而Tr无明显改变(图4C)。由此可见，褪黑素预处理能显著提高干旱胁迫下小麦叶片的光合能力，其中25 μmol·L-1褪黑素预处理效果最明显。

图4 褪黑素对干旱胁迫下小麦叶片气体交换参数的影响

2.4 褪黑素对干旱胁迫下小麦叶片PS Ⅱ活性的影响

正常条件下，褪黑素预处理后小麦叶片的最大荧光(Fm)和PS Ⅱ最大光化学效率(Fv/Fm)没有显著变化(图5)。而干旱胁迫下，褪黑素预处理可缓解干旱胁迫导致的Fm和Fv/Fm下降，5、25及100 μmol·L-1褪黑素预处理的Fm较D处理分别增加了16.42%、44.03%和38.81%，Fv/Fm分别增加了4.92%、16.39%和11.48%，表明褪黑素预处理能减轻干旱胁迫对小麦PS Ⅱ的损伤。

图5 褪黑素对干旱胁迫下小麦叶片Fm和Fv/Fm影响

2.5 褪黑素对干旱胁迫下小麦叶片P700参数的影响

正常条件下，褪黑素预处理对小麦叶片的最大P700信号(Pm)及PSⅠ有效量子产量(ΦPSI)、供体侧的氧化态(ΦND)和受体侧的还原态(ΦNA)均无显著影响(图6)。干旱胁迫下，褪黑素预处理能够显著减缓干旱胁迫导致的Pm和ΦPSI下降，5、25及100 μmol·L-1褪黑素预处理的Pm分别较D处理分别增加了15.56%、73.33%和 44.44%(图6A)，ΦPSI分别增加了21.74%、 30.43%和26.09%(图6B)；而干旱胁迫下，25 和100 μmol·L-1褪黑素预处理的小麦叶片ΦND显著增加；D处理的ΦNA较CK显著上升，增幅为400.00%(图6C)，而干旱胁迫下5 、25及100 μmol·L-1褪黑素预处理较D处理显著降低了小麦叶片ΦNA，降幅分别为22.86%、65.71%和45.71%(图6D)，但三者的ΦNA水平仍高于CK，说明干旱胁迫下褪黑素预处理可有效减轻干旱胁迫造成的PSⅠ损伤，增加其活性。

图6 褪黑素对干旱胁迫下小麦叶片P700参数的影响

2.6 褪黑素对干旱下小麦PSⅠ蛋白含量的影响

从蛋白免疫印迹结果(图7A和B)看，干旱胁迫显著降低了小麦叶片PSⅠ的Lhca2蛋白含量，干旱胁迫下褪黑素预处理可显著缓解Lhca2蛋白含量的降低，而对PsaD、Lhca1、Lhca3和Lhca4蛋白的含量无明显影响。定量分析结果表明，褪黑素预处理可显著缓解干旱胁迫下Lhca2蛋白的减少，其中以100 μmol·L-1褪黑素处理的小麦叶片Lhca2蛋白相对含量下降最少(图7A和 E)。而正常及干旱胁迫下的小麦叶片PsaD、Lhca1、Lhca3和Lhca4蛋白的相对含量均无明显变化(图7C、D、F和H)。

A:光系统I蛋白免疫印记; B:类囊体膜蛋白考马斯亮蓝染色。

3 讨 论

作物对干旱胁迫的响应是一个十分复杂的过程，干旱胁迫影响植物的萌发和正常生长，不同作物品种对于干旱胁迫的响应存在着显著差异。植株的生物量和含水量是评价作物抗旱性的重要指标[43-44]。植物的地上部生物量也可一定程度上反映植株的生长状况，而植物组织的相对含水量可以反映植物体内水分亏缺程度，体现植物的抗旱性[45-46]。外源褪黑素的施用可提高植物的抗逆能力，增强植物对干旱胁迫的耐受性[21,30-32]。本研究与前人的研究结果均显示，干旱胁迫显著抑制小麦在萌发期的生长，在苗期则会使小麦叶片的相对含水量和地上部生物量均呈现降低趋势，而褪黑素的处理在一定程度上均促进小麦的萌发及幼苗的生长，显著减小了小麦的叶片相对含水量及地上部生物量下降幅度，明显改善植株体内的水分状况，说明褪黑素预处理能有效增加小麦的抗旱性。

光合色素尤其是叶绿素在光合作用中对光能的吸收、传递及光化学反应起着重要的作用，而类胡萝卜素具有提高光合效率、抑制和清除自由基的作用。光合色素的含量通常直接影响着光合作用和光合产物的形成，最终影响作物的产量和品质[47]。研究显示，植物干旱缺水会增加叶绿体内氧自由基含量的积累，大量的活性氧会引发叶绿素的破坏，使得叶绿素含量降低[48]，因此干旱胁迫会造成光合能力下降[49]。同时，光合速率的分析通常采用叶肉细胞间CO2浓度(Ci)作为指标[50]，干旱胁迫会导致叶片气孔收缩，进而导致光合速率下降[51]。本研究发现，褪黑素处理对正常条件下小麦叶片的叶绿素、类胡萝卜素含量及气孔活动基本无影响。而干旱胁迫下外源褪黑素处理则增加了小麦叶片的光合色素含量，并有效缓解了Pn、Gs的下降，且不同浓度褪黑素的促进效果存在一定差异，其中以25 μmol·L-1褪黑素处理效果最佳，而褪黑素处理对Tr基本无影响。这说明褪黑素处理能够提高干旱胁迫下植物光合色素含量，增加气孔导度，这与褪黑素能够增强植物逆境下的光合作用是一致的[21,30-31]。此外，本研究中干旱胁迫下经褪黑素处理过的小麦叶片花青素含量显著增加，而花青素具有清除活性氧的作用[52]，说明褪黑素能诱导干旱胁迫下花青素的快速积累，从而清除由干旱胁迫引起的活性氧积累，增强小麦的抗旱能力[53]。

植物叶绿素荧光参数是灵敏、无机械损伤研究和评价逆境下植物光合作用的重要参考指标，可以直接反映植物的生长、病害及受胁迫情况[54-55]。本研究中，干旱胁迫下小麦的Fm和Fv/Fm值均降低，表明干旱胁迫降低了PS Ⅱ的原初光能转化效率及潜在活性，进而使PS Ⅱ的光化学活性受到抑制。褪黑素处理可有效缓解干旱胁迫下小麦Fm和Fv/Fm的下降，表明褪黑素能改善干旱胁迫下小麦叶片PS Ⅱ的能量转化，减轻干旱胁迫对小麦PS Ⅱ的损伤，增强干旱胁迫下PS Ⅱ的光化学活性。根据前人研究，环境胁迫下，PS Ⅱ能够进行快速修复，而PSⅠ无修复机制，因此一旦PSⅠ发生损伤，植物的光合效率会明显下降[56]。Pm是远红光适应后打开饱和脉冲测量的最大P700信号，类似于荧光测量中的Fm。本研究中，Pm与Fm的变化趋势相似，说明无论是PSⅠ还是PS Ⅱ，在干旱胁迫下都明显会受到破坏，而褪黑素处理能减轻植物光系统受损程度。

本研究通过测量小麦叶片ΦPSI、ΦND、ΦNA以及PSⅠ蛋白含量，以进一步探讨PSⅠ的光化学活性。结果显示，褪黑素对正常环境条件下小麦的ΦPSI、ΦND、ΦNA基本无影响。干旱胁迫下，小麦ΦPSI水平的降低及ΦNA水平的上升说明干旱胁迫使小麦PSⅠ的受体侧受到抑制，而PSⅠ受体侧限制引起的非光化学能量耗散增加，这可能是因为干旱胁迫抑制光合速率，从而导致PSⅠ受体侧电子累积产生活性氧，造成PSⅠ损伤。而褪黑素可通过清除活性氧，降低ΦNA的水平，从而保护PSⅠ以提高干旱胁迫下小麦PSⅠ的实际光合效率，这与前人关于褪黑素的抗氧化研究结果是一致的[21]，但不同浓度的褪黑素的作用效果存在着较大差异。同时，褪黑素处理可提高干旱胁迫下ΦND的水平，表明干旱胁迫下褪黑素不仅能增强PS Ⅱ光化学活性，也可降低PSⅠ供体侧限制引起的非光化学能量耗散。此外，干旱胁迫下PSⅠ的Lhca2蛋白含量明显降低，而褪黑素处理可缓解Lhca2蛋白的下降，表明褪黑素对干旱胁迫下小麦PSⅠ的影响可能主要通过调节Lhca2蛋白的含量来发挥作用。

到目前为止，尚不清楚褪黑素是如何保护干旱胁迫下小麦PSⅠ。研究表明，褪黑素可以提高干旱胁迫下小麦PS Ⅱ的活性，但是逆境条件下PS Ⅱ的稳定可能会导致PSⅠ过度激发，使PSⅠ受到氧化损伤[57]。褪黑素如何同时保护两个光系统需要深入讨论。对于PSⅠ的保护需要分析光系统之间吸收能量的分配，植物通过状态转换来实现光系统之间激发平衡[58-60]。状态转换主要取决于LHCⅡ蛋白的磷酸化以及其与结合的PSI-H蛋白[61-62]，褪黑素已被报道能够影响多个蛋白激酶[21]，褪黑素和使LHCⅡ蛋白磷酸化的STN7蛋白激酶之间是否存在关系还需进一步探究。PSⅠ受体侧调节和供体侧调节与环式电子传递密切相关[63]。Shi等[64]通过转录组数据推测褪黑素能够提高植物PGR5蛋白含量，PGR5蛋白是环式电子传递过程中的关键蛋白，褪黑素对于干旱胁迫下小麦环式电子传递和PGR5蛋白表达水平的影响需要进一步研究。综上所述，褪黑素对小麦干旱胁迫下的生理机能及光合效能均有一定的促进作用，具体机制需要进一步深入 研究。