柠檬酸对机体生长及消化功能影响的研究

袁 梦 黄慧清 陈 澜 朱锦平 马燕梅

(福建农林大学动物科学学院（蜂学学院） 福州 350002)

2020 年7 月1 日饲料抗生素全面禁用以来，天然饲料添加剂得到了广泛关注。酸化剂作为高效、无残留、无副作用的添加剂，在促进动物生长方面有着较为显著的作用，是一种常见的饲料添加剂。酸化剂种类很多，主要分为单一酸化剂（无机酸化剂与有机酸化剂）和复合酸化剂两种。 随着养殖业的发展，有机酸添加剂在畜禽生产上的应用越来越广泛， 其中柠檬酸的应用较为普遍。 柠檬酸可以掩盖饲料中因添加矿物质、维生素等引发的不良气味，起到调节饲料风味的作用，从而改善日粮的适口性。 周梦佳等[1]研究表明，有机酸可以提升肠道消化吸收能力，为肠道提供适宜的酸度， 使无活性的胃蛋白酶原转化为有活性的胃蛋白酶，有利于营养物质的消化吸收。酸化剂可以提高动物的生产性能。 刘新泽等[2]报道复合酸化剂可以显著提高血清免疫球蛋白含量， 从而提高动物机体免疫力，进一步改善生产性能。有机酸还可以改善肠道微生态， 摄入有机酸后偏酸性的微环境对大肠杆菌等病原菌的生长繁殖起到了抑制作用，为胃肠道提供健康的环境。 研究表明，酸化剂对标准大肠杆菌、标准金黄色葡萄球菌、标准沙门氏菌及临床分离大肠杆菌均具有不同程度的抑菌作用[3]。曾子悠等[4]报道饲粮添加植物精油和酸化剂组合可以提高麻黄肉鸡生长性能，改善免疫器官指数、空肠形态和肉品质。 沈一茹等[5]试验表明饲粮中添加酸化剂可以显著提高肠道绒毛隐窝比及杯状细胞数量， 进一步改善肉鸡生长性能和肠道发育。 本研究通过体外抑菌试验和消化道平滑肌收缩试验， 并给小鼠饲喂不同浓度的柠檬酸溶液， 探究柠檬酸促进机体生长及提高机体消化功能的机制， 为饲料酸化剂的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 6~8 周龄SPF 级C57BL/6 小鼠和2.0±0.02 kg 普通家兔，均购自闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司。

1.2 主要试剂 胃蛋白酶测定试剂盒 （比色法）和胰蛋白酶测定试剂盒（比色法）购自南京建成生物工程 研 究 所；TRYPTONE、YEAST EXTRACT、Agar 购自OXOID 公司；头孢噻肟、强力霉素、多粘菌素B、青霉素、 阿莫西林药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 柠檬酸抑菌试验 试验设置1 个对照组和2 个试验组，均使用固体LB 琼脂培养基。 对照组使用商品化头孢噻肟、强力霉素、多粘菌素B、青霉素、阿莫西林药敏片， 试验组1 接种大肠杆菌标准株（ATCC 25922）， 试 验 组2 接 种 葡 萄 球 菌 标 准 株（ATCC 25923）， 各试验组使用不同柠檬酸浓度（0%、1%、5%、10%和15%）的自制试纸片，测量并比较柠檬酸抑菌圈和五种常用抗生素抑菌圈的直径。

1.4 离体肠道平滑肌收缩试验 试验前将小鼠和兔禁食数小时后处死并立即剖开腹腔， 找到胃幽门和十二指肠交界处，以此为起点取长20~30 cm 的肠管，迅速将标本放入台氏液中，并用台氏液冲洗肠腔内容物。 冲洗干净后，将肠管剪成数段，每段长2~3 cm，置于台氏液中备用。 使用BL-420E+生物机能实验系统测定不同浓度柠檬酸对离体肠道平滑肌的收缩频率（次/min）和收缩强度，计算肠管的肠道活动力（肠道活动力=平均强度×频率， 单位：g·次数/min）。

1.5 柠檬酸对小鼠生长与消化功能的影响 选择20 只体重相近的6 周龄SPF 级C57BL/6 小鼠饲养于EVC 鼠笼，分为5 组：对照组和4 组试验组，每组4 只小鼠，对照组正常饮水，试验组分别饲喂柠檬酸浓度为0.05 g/L、0.1 g/L、0.15 g/L 和0.2 g/L 的饮用水。 饲养周期14 d，每3 d 称量小鼠体重，以饲养天数为横坐标、 体重差值为纵坐标绘制小鼠体重生长曲线。

第14 d， 采用摘除眼球采血法采集小鼠全血1 mL， 在37 ℃温箱静置30 min 后8 000×g 常温离心5 min，取血清。 处死小鼠并立即剖取胃、小肠，并分别收集内容物至灭菌EP 管。 按照胃蛋白酶和胰蛋白酶测定试剂盒说明进行操作，分别检测血清、胃内容物和小肠内容物消化酶活性。

剖14 d 小鼠， 取1 cm 空肠用1×PBS 冲洗后用固定液固定24 h，将固定好的肠管组织送至武汉塞维尔公司委托其制作HE 组织切片并扫描。 运用CaseViewer 软件测量每个样本的绒毛长度和隐窝深度并计算绒毛与隐窝的比值。

2 结果与分析

2.1 柠檬酸抑菌圈试验结果 由表1-表2 可知，柠檬酸对大肠杆菌和葡萄球菌均有抑制作用， 随着柠檬酸浓度增加，其抑菌效果也递加。 对于大肠杆菌，10%柠檬酸的抑菌效果与阿莫西林抑菌效果相似，15%柠檬酸的抑菌效果与头孢噻肟相似。 对于葡萄球菌，10%柠檬酸抑菌效果与多西环素抑菌效果相似，15%柠檬酸的抑菌效果与阿莫西林相似。

表1 柠檬酸对大肠杆菌的抑制作用

表2 柠檬酸对葡萄球菌的抑制作用

2.2 平滑肌收缩试验结果 在离体肠道平滑肌收缩试验中，由图1、图2 可知，柠檬酸浓度为0.1 g/L和0.15 g/L 时， 随着柠檬酸浓度升高鼠肠道活动力越高， 当柠檬酸浓度达到0.1 g/L 和0.15 g/L 时，鼠肠道活动力极显著提高（P＜0.01）。 由图3、图4 可知，柠檬酸浓度为0.1 g/L 和0.15 g/L 时，随着柠檬酸浓度升高兔肠道活动力越高， 当柠檬酸浓度达到0.1 g/L 和0.15 g/L 时， 兔肠道活动力极显著提高（P＜0.01）。

图1 柠檬酸对鼠肠道平滑肌收缩影响波形图

图2 柠檬酸对鼠肠道活力的影响

图3 柠檬酸对兔肠道平滑肌收缩影响波形图

图4 柠檬酸对兔肠道活力的影响

2.3 柠檬酸对小鼠生长与消化功能的影响 图5结果显示，随着时间推移，小鼠体重不断增加，与对照组相比，柠檬酸浓度为0.1 g/L 时，小鼠14 d 体重差值最高。

图5 柠檬酸对小鼠的生长影响

消化酶活性测定结果见图6、图7 和图8。 与对照组相比，0.1 g/L 浓度组胃蛋白酶活力和血清胰蛋白酶活力有增长趋势。 肠内容物胰蛋白酶活力结果表明，与对照组相比，0.1 g/L 浓度组极显著提高（P＜0.01），0.15 g/L 浓度组显著提高（P＜0.05）。

图6 柠檬酸对胃蛋白酶活性的影响

图7 柠檬酸对血清胰蛋白酶活性的影响

图8 柠檬酸对肠胰蛋白酶活性的影响

由图9 可知， 与对照组相比， 柠檬酸浓度达到0.1 g/L 和0.15 g/L 时， 小肠绒毛长度与隐窝深度比值极显著增高（P＜0.01）。

3 讨 论

图9 柠檬酸对肠绒毛长度与隐窝深度比值的影响

3.1 柠檬酸的抑菌作用 本试验选择革兰氏阳性菌葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌进行柠檬酸抑菌圈试验。试验结果表明，不同浓度柠檬酸对大肠杆菌和葡萄球菌的生长均有抑制效果， 随着柠檬酸浓度增加，抑菌效果越好。 大肠杆菌培养基中15%浓度柠檬酸的抑菌效果与头孢噻肟相当， 葡萄球菌培养基中15%浓度柠檬酸的抑菌效果与阿莫西林相当。 朱爱民等[6]研究发现酸化剂处理断乳仔猪能使其粪便中大肠杆菌和沙门氏菌显著降低。除此之外，孙建华等[7]研究发现酸化剂不仅能显著降低肠道有害菌的数量， 而且能显著提高肠道有益菌乳酸杆菌的数量。 郑建婷等[8]试验得出饲粮中添加柠檬酸能增加优势菌属的种类，从而提高微生物多样性。

3.2 柠檬酸对肠道平滑肌收缩功能的影响 肠道的消化吸收能力与肠道平滑肌的收缩功能密切相关。 本试验结果表明，与空白对照组相比，含0.1 g/L和0.15 g/L 柠檬酸的台氏液环境能极显著提高鼠与兔的肠道活动力。 适当的H+浓度促进钙通道激活，肌纤蛋白对Ca2+敏感性升高，肌质网释放Ca2+增多，故平滑肌收缩力加强[9]，柠檬酸添加浓度过高或时间过长均会改变肠道活动力。

3.3 柠檬酸对物质代谢与营养功能的影响

3.3.1 柠檬酸对生长性能的影响 在饮水或饲料中添加适量的柠檬酸，能提高动物生长性能。本试验结果表明，柠檬酸能提高小鼠的增重，促进小鼠生长，以饮水中添加0.1 g/L 柠檬酸效果最佳。 Liao 等[10]报道在15～35 日龄肉鸭饮水中添加柠檬酸(0.068%)不仅能降低大肠杆菌数量，还可提高肉鸭采食量，从而达到提高生长性能的目的。 在饲料中添加柠檬酸不仅能提高肠道消化吸收能力，还能改善日粮适口性。池仕红等[11]研究表明不同种类的酸化剂均能提高断乳仔猪生长性能。 何荣香等[12]通过试验证明在断乳仔猪饲粮和饮水中单独或组合添加有机酸均可提高断乳仔猪的生长性能。大量研究表明，柠檬酸可以提高动物采食量， 提高其生长性能， 促进动物健康成长，与本试验结果一致。

3.3.2 柠檬酸对消化酶活性的影响 pH 是影响消化道酶活性的重要因素之一， 消化酶在偏酸性的环境中发挥作用更强，尤其是胃蛋白酶，柠檬酸能促进无活性的胃蛋白酶原转化为具有活性的蛋白酶，以有效水解蛋白质[13]。 本试验表明柠檬酸可以提高胃蛋白酶和血清蛋白酶活性， 但不同浓度组别间差异不显著。我们研究发现饲喂柠檬酸浓度0.1 g/L 饮用水的小鼠，其肠内容物胰蛋白酶活性极显著提高。与孙建华等[7]研究两种复合酸化剂对肉鸡胃蛋白酶、胰蛋白酶活性的影响结果相似。

3.3.3 柠檬酸对小肠黏膜形态及绒毛隐窝比的影响小肠是动物机体进行消化吸收的主要场所。 良好的小肠黏膜形态结构对促进肠道生理功能有重要的作用。 小肠绒毛加长，隐窝加深，可使小肠与食糜接触的面积增加，促进营养物质消化吸收。本研究结果显示，与对照组相比，柠檬酸浓度为0.1 g/L 和0.15 g/L的试验组，小肠绒毛隐窝比极显著提高。程卓等[14]研究柠檬酸对草鱼肠道组织形态影响， 发现添加0.15%～0.45%柠檬酸的草鱼肠道绒毛高度显著提高。 王庆争等[15]研究表明0.1%酸化剂在与血浆蛋白粉合用情况下能使28 日龄、35 日龄仔兔的十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度显著增加，隐窝深度显著降低。

4 结 论

柠檬酸有促进机体生长及提高消化功能的作用，主要通过抑制有害菌的生长、提高消化道平滑肌的收缩强度及频率、 促进消化酶活性及改善肠道黏膜形态、 增大营养物质的消化吸收面积来实现。 综合本试验结果， 以添加柠檬酸浓度为0.1 g/L 和0.15 g/L 效果较好。