高产L-苏氨酸的缺陷型大肠杆菌发酵条件优化研究

张昱阳，朱红薇，杨 洋，袁 成，朱长俊

（嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314000）

苏氨酸（Threonine）是人体和动物必需的8 种氨基酸之一，有改善机体免疫、促进人体及禽畜生长等功能。被广泛用于医药、食品强化剂和饲料添加剂等方面[1-2]。目前，苏氨酸主要通过大肠杆菌等微生物发酵制备[3]。通过对高产L-苏氨酸的大肠杆菌发酵条件优化，可有效提高L-苏氨酸产量[4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉汤培养基、种子培养基、基本培养基、大肠杆菌发酵培养基，具体配方见文献[5]；经过育选的赖氨酸、甲硫氨酸缺陷型大肠杆菌，本实验室保存。L-苏氨酸标准溶液（1.63×10-4mol/L）；四氯对苯醌乙醇溶液（3.0×10-3mol/L）；硼砂溶液（0.1 mol/L）。

1.2 仪器与设备

UV-1100 紫外分光光度计，SBA1243 电子分析天平；Eppendorf 5810R 离心机。

1.3 试验方法

试验流程如图1 所示。

图1 试验流程图

1.3.1 菌种活化及菌悬液制备

实验室保存菌株活化，扩大培养。无菌生理盐水制备成菌悬液，稀释至108～109CFU/mL。

1.3.2 L-苏氨酸标准曲线的测定

取0.5 g/L 的L- 苏氨酸标准溶液，配制成4 μg/mL、8 μg/mL、12 μg/mL、16 μg/mL、20 μg/mL、24 μg/mL 和28 μg/mL 的系列标准溶液。取1.0 mL不同浓度的L-苏氨酸系列标准溶液于10 mL 容量瓶中，加0.5 mL 硼砂溶液（0.1 mol/L）和1.5 mL 四氯苯醌溶液（3.0×10-3mol/L），定容；50 ℃水浴40 min，冷却至室温；以相同方法制备试剂空白为参比，在λ=352 nm 处测其吸光度，重复3 次[6]。

1.3.3 发酵液中L-苏氨酸含量测定

发酵液4 000 r/min 离心20 min，保留上清液并稀释至500 倍，测定稀释液中L-苏氨酸含量。根据L-苏氨酸标准曲线求不同发酵液中L-苏氨酸的含量[7]。

1.3.4 发酵培养基优化

参考赖慧彪等[8]的研究结果，原培养基成分葡萄糖、玉米浆及硫酸铵对发酵结果影响相对较大，其他组分相对含量较少且影响较小。设置不同葡萄糖含量（20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L 和60 g/L）、玉米浆含量（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L 和25 g/L）、硫酸铵含量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L 和50 g/L）进行单因素试验确定因素范围，使用Design Expert软件，进行3 因子和3 水平响应面试验。

以5%的接种量吸取1 mL 的赖氨酸缺陷型大肠杆菌菌悬液，接入20 mL 发酵培养液中，每组3 瓶，37 ℃摇床培养48 h；测定每组的L-苏氨酸含量，进行响应面分析得出最佳发酵培养基方案[9]。

1.3.5 摇瓶发酵工艺优化

装液量以10 mL、15 mL、20 mL、25 mL 和30 mL分组；接种量以1%、3%、5%、7%和9%分组；摇床温度以31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃和43 ℃分组；摇床转速以140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min和220 r/min 分组。恒温培养，测定L-苏氨酸产量，确定最优方案，大致过程同L-苏氨酸含量测定[10]。

2 结果与分析

2.1 L-苏氨酸标准曲线

L-苏氨酸标准曲线y=0.062x-0.048 4，R2为0.993 7，拟合度较高，据此计算后续L-苏氨酸产量较为准确。

2.2 发酵培养基优化结果

2.2.1 培养基优化单因素试验结果

图2为培养基优化单因素试验结果。葡萄糖含量为40 g/L 时出现L-苏氨酸产量峰值，即取30 g/L、40 g/L、50 g/L 为葡萄糖因素的3 水平（模型A）；玉米浆含量为10 g/L 时出现L-苏氨酸产量峰值，即取5 g/L、10 g/L、15 g/L为玉米浆因素的3水平（模型B）；硫酸铵含量为20 g/L 时出现L-苏氨酸产量峰值，即取10 g/L、20 g/L、30 g/L 为玉米浆因素的3 水平（模型C）。

图2 发酵培养基优化单因素试验结果

2.2.2 培养基优化响应面试验结果

根据单因素试验结果设计响应面试验因素水平，通过软件得出17 种不同发酵培养基组合，其回归方程为Y=5.39+0.13A+0.17B+0.080C-0.047AB+0.14AC-0.25BC-0.89A2-0.31B2-0.34C2。由表1 可知，模型的P＜0.000 1，表明试验所设计的二次多元模型显著，结果较为可靠。失拟项为0.178 5 ＞0.05，不显著，说明其他未知因素对试验影响较小。决定系数R2为0.990 3，调整系数为0.977 9，两者相差小于0.2，说明试验设计恰当，所得模型有效，且所得结果可用来推测发酵培养基最佳组分。

表1 回归模型的方差分析和系数显著性检验

葡萄糖、玉米浆和硫酸铵之间的响应面图及等高线图更能反映出每种因素相互之前的作用对L-苏氨酸产量的影响。由图3 可知，玉米浆和硫酸铵等高线颜色变化最快，曲线更为弯曲，说明玉米浆和硫酸铵的相互作用较葡萄糖和玉米浆、葡萄糖和硫酸铵来说更显著。

图3 发酵培养基组分响应面和等高线图

软件分析得出发酵培养基中葡萄糖、玉米浆及硫酸铵最佳的配比量为41.0 g/L、11.0 g/L、20.0 g/L。即最终优化发酵培养基配方为葡萄糖4.1%、玉米浆1.1%、硫酸铵2.0%、K2HPO40.01%、MgSO4·7H2O 0.005%、FeSO4·7H2O 0.001%以及MnSO4·H2O 0.001%，pH 为7.0 ～7.2。

2.3 摇瓶发酵工艺优化结果

发酵培养基装液量为20 mL、接种量为5%、摇床温度为37 ℃以及摇床转速为220 r/min时产出的L-苏氨酸最多，摇瓶发酵工艺优化结果见图4。

图4 摇瓶发酵工艺优化结果

2.4 最终优化后发酵液中L-苏氨酸产量测定

最后对比优化和未优化发酵工艺下不同营养缺陷型菌株的L-苏氨酸产量，由表2 可知，L-苏氨酸的产量大幅提升，与胡丹等[11]工艺优化后的L-苏氨酸产量（2.06 g/L）相比也具有显著优势。

表2 使用优化工艺和未使用优化工艺的L-苏氨酸产量对比

3 结论与讨论

在发酵培养基、摇瓶工艺优化条件下可有效提高L-苏氨酸的产量。赖氨酸缺陷型菌株的L-苏氨酸产量为5.90 g/L，与优化前（4.06 g/L）相比产率提高45.32%，甲硫氨酸缺陷型菌株的L-苏氨酸产量为5.76 g/L，比优化前相比（3.89 g/L）产率提高48.07%。笔者接下来除优化培养基的配比外，还可以探索是否有更适合的碳源、氮源，添加其他生长因子、微量元素是否可以促进发酵。生产L-苏氨酸的代谢途径中存在着反馈抑制，是否可通过对反馈抑制进一步调控提高发酵效率。