黄曲霉毒素B1 免疫层析试纸条和ELISA 试剂盒中花生粕样本适用性优化

张君超，田秀梅，王 艳，闵国春，靳 曼，陈 年

（1.北京美正生物科技有限公司，北京 102200；2.湖北省孝感市公共检验检测中心，湖北孝感 432000；3.三峡公共检验检测中心，湖北宜昌 443000；4.辽宁省粮食检验检测中心，辽宁沈阳 110032）

中国是花生种植大国，花生年产量从2017 年连续5 年在1 700 万t 以上，是全球花生主要产区。目前国内花生仍以榨油和食用为主，花生粕是花生果仁经压榨等方式制油后产生的副产品，由于花生种皮薄、粗纤维含量低，压榨后的花生粕蛋白质含量高且氨基酸种类丰富，可以应用在食品、保健品和饲料中[1-2]。但由于花生粕中精氨酸、赖氨酸和蛋氨酸等氨基酸不平衡和大分子蛋白质消化利用率低，以及在贮存过程中极易发生霉变而产生黄曲霉毒素等原因，影响了花生粕蛋白的广泛、综合使用[3-4]。随着花生粕深加工技术的发展以及饲用豆粕减量替代行动方案的实施，花生粕近年来在食品和饲料中的应用更为广泛。

黄曲霉毒素是曲霉属真菌的次生代谢产物，主要有黄曲霉毒素B1、B2、G1和G24 种，其中AFB1的毒性和致癌性最强，严重影响食品和饲料的质量安全[5-6]。目前花生粕中黄曲霉毒素B1的检测方法有液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法、电化学法、酶联免疫吸附法、时间分辨荧光免疫层析法、胶体金快速定量法和胶体金定性法等多种方法[7-8]。液相色谱-串联质谱、高效液相色谱等仪器检测方法的准确度高、稳定性好、灵敏度高，已作为法检方法使用，但仪器设备相对昂贵、对检测人员的要求高，不适合在食品加工企业、饲料加工企业以及花生粕原料贸易中广泛应用。而基于免疫学的快速检测方法因其快速、简便、成本低的特点，适用于基层用户现场大批量快速检测，在基层中应用较为广泛[9-10]。因此，花生粕中黄曲霉毒素B1含量的快速、准确测定对于食品及饲料质量安全控制意义重大。

为在基层检测中更加准确地检出花生粕中黄曲霉毒素B1，给予生产及贸易企业有效的参考，本实验在原有商业化快速检测产品的基础上，通过对比不同提取溶剂对花生粕中黄曲霉毒素B1快速检测结果的影响，选取了最优的提取溶剂用于酶联免疫吸附法、荧光/胶体金免疫层析快速定量法等快速检测方法。本实验增加了黄曲霉毒素B1的快速检测商品化产品中花生粕样本的适用性。

1 材料与方法

1.1 材料

花生粕样品：来源于油脂生产企业、花生粕贸易企业和饲料加工企业。

1.2 主要试剂与仪器

乙腈、甲醇均为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；黄曲霉毒素B1ELISA 检测试剂盒、黄曲霉毒素B1荧光快速定量检测试纸条和黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试纸条（北京华安麦科生物技术有限公司）。

天平（PL602E，梅特勒-托利多）；多管涡旋仪（HMG-WX，北京美正生物科技有限公司）；离心机（TG16-W，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；酶标分析仪（HF4500，北京华安麦科生物技术有限公司）；荧光定量快速检测及监测分析系统（HYG001，北京华安麦科生物技术有限公司）和胶体金定量快速检测及监测分析系统（HMG001，北京华安麦科生物技术有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 花生粕中黄曲霉毒素B1检测方法

①酶联免疫法。除提取溶剂外，前处理方法和检测方法参照黄曲霉毒素B1ELISA 检测试剂盒（北京华安麦科生物技术有限公司）产品说明书。②荧光/胶体金免疫层析快速定量法。除提取溶剂外，前处理方法和检测方法参照黄曲霉毒素B1胶体金/荧光快速定量检测试纸条（北京华安麦科生物技术有限公司）产品说明书。

1.3.2 酶联免疫法中不同提取溶剂对花生粕中黄曲霉毒素B1检测结果的影响

根据黄曲霉毒素B1自身理化性质、现行的检测方法常用到的提取溶剂以及商品化快速检测产品的有机溶剂耐受性，选取60%甲醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水3 种溶剂提取，经《饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2 毒素的测定 液相色谱-串联质谱法》（NY/T 2071—2011）定值的花生粕样本，使用黄曲霉毒素B1ELISA 检测试剂盒检测，对比不同提取溶剂对检测结果的影响。

1.3.3 荧光/胶体金快速定量免疫层析法中不同提取溶剂对花生粕中黄曲霉毒素B1检测结果的影响

根据黄曲霉毒素自身理化性质、现行的检测方法常用到的提取溶剂以及商品化快速检测产品的有机溶剂耐受性，选取50%乙醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水3 种溶剂提取，经《饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2 毒素的测定 液相色谱-串联质谱法》（NY/T 2071—2011）定值的花生粕样本，使用黄曲霉毒素B1荧光/胶体金快速定量检测试纸条检测，对比不同提取溶剂对检测结果的影响。

2 结果与分析

2.1 酶联免疫法中不同提取溶剂对花生粕中黄曲霉毒素B1 检测结果的影响

花生粕经60%甲醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水不同提取溶剂提取后使用商品化黄曲霉毒素B1ELISA 检测试剂盒检测结果如表1 所示。结果显示，与定值结果相比，用60%甲醇-水溶剂提取的样品检测结果偏低，回收率在68.1%～78.5%；而用80%乙腈-水溶剂提取的样品检测结果偏高，回收率在120.7%～203.0%；用30%乙腈-水溶剂提取的样品检测结果的回收率在95.1%～109.0%。实验结果表明，不同提取溶剂的提取效率有所差异，对于所使用的商品化ELISA 检测试剂盒来讲，其更适合使用30%乙腈-水溶剂提取花生粕中黄曲霉毒素B1。

表1 酶联免疫法检测花生粕中黄曲霉毒素B1

2.2 荧光定量免疫层析法中不同提取溶剂对花生粕中黄曲霉毒素B1 检测结果的影响

花生粕经50%乙醇-水、30%乙腈-水、80%乙腈-水不同提取溶剂提取后，使用商品化黄曲霉毒素B1荧光快速定量检测试纸条检测结果如表2 所示。实验结果显示，与定值结果相比，用50%乙醇-水溶剂提取的样品检测结果偏低，回收率在46.8%～73.7%；用80%乙腈-水溶剂提取的样品检测结果也偏低，回收率在59.0%～73.1%；而用30%乙腈-水溶剂提取的样品检测结果回收率在88.5%～99.9%。结果表明不同提取溶剂的提取效率有所差异，对于所使用的商品化荧光快速定量检测试纸条来讲，其更适合使用30%乙腈-水溶剂提取花生粕中黄曲霉毒素B1。

表2 荧光定量免疫层析法检测花生粕中黄曲霉毒素B1

2.3 胶体金定量免疫层析法中不同提取溶剂对花生粕中黄曲霉毒素B1 检测结果的影响

花 生 粕 经50% 乙 醇- 水、30% 乙 腈- 水、80%乙腈-水不同提取溶剂提取后，使用商品化黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试纸条检测结果如表3 所示。结果显示，与定值结果相比，用50%乙醇-水溶剂提取的样品检测结果偏低，回收率在56.2%～66.9%；用80%乙腈-水溶剂提取的样品检测结果也偏低，回收在67.2%～84.9%；而用30%乙腈-水溶剂提取的样品检测结果的回收在84.5%～103.3%。结果表明不同提取溶剂的提取效率有所差异，对于所使用的商品化胶体金快速定量检测试纸条来讲，其更适合使用30%乙腈-水溶液提取花生粕中黄曲霉毒素B1。

表3 胶体金定量免疫层析法检测花生粕中黄曲霉毒素B1

3 结论

本实验结果显示，商品化黄曲霉毒素B1快速检测花生粕的结果因提取溶剂的不同，回收率不同，现有商品化快速检测产品中提取溶剂不适用花生粕的检测。经对比，30%乙腈-水提取溶剂均适用于商品化黄曲霉毒素B1ELISA 检测检测试剂盒、黄曲霉毒素B1荧光快速定量检测试纸条和黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试纸条。食品加工企业、饲料加工企业以及花生粕原料贸易可使用此方法对花生粕中黄曲霉毒素B1进行快速检测。

本实验是基于现有商品化快速检测产品进行开展，并未对市面上所有商品快速检测产品进行研究，此提取溶剂不一定适用于其他商品化快速检测产品。不同提取溶剂的选择对液相色谱-串联质谱法和高效液相色谱法等仪器检测方法是否也有同样的影响还需进一步探讨及研究。