高效液相色谱质谱联用法在食品中四环素类药物残留检测中的应用

赵 琪

（哈尔滨海关技术中心齐齐哈尔综合实验室，黑龙江齐齐哈尔 161000）

高效液相色谱质谱联用法在四环素类药物残留检测中应用广泛，该方法具有分离度高、分析速度快及灵敏性强等优势，深受检测单位青睐，同时该方法的研究发展也推动了食品中药物残留检测领域的发展。随着科技的发展，食品类别不断增加，同时食品组分、加工方法、加工步骤等日益烦琐复杂，为食品中药物残留检测增加了难度。在开展药物残留检测时，由于食品组分分离不彻底，会对最终的检测结果产生影响，而利用高效液相色谱质谱联用法可有效解决存在的问题。质谱法和色谱法均是检测四环素类药物的方法之一，但从实际应用结果来看，由于质谱法在定量分析时过于烦琐，应用时受到限制，而色谱法定性能力较弱，因此两种方法各有优缺点，高效液相色谱质谱联用法的出现为更精确地检测四环素类药物在食品中的残留提供了保障[1]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土霉素（TC）标准品、四环素（OTC）标准品、金霉素（CTC）标准品及美他环素（MTC）标准品，中国药品生物制品检定所。内标物地塞米松（DM），中国药品生物制品检定所；纯牛奶，沈阳蒙牛达能乳制品有限公司；甲醇，色谱纯；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

LCQ 型液相色谱-质谱联用仪（Finnigan 公司）；色谱柱（Hypersil BDS C18，150 mm×5.0 mm，5 μm，大连依利特科学仪器有限公司）；MT 型样品净化富集柱（250 mg，天津富集色谱技术开发公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

取牛奶样品2 mL，加入2 mL 水，充分混合搅拌均匀。分别使用5 mL甲醇和10 mL水活化C18小柱，使用注射器吸取10 mL 牛奶混合液体以1 mL/min 的速度过C18小柱，弃去流出液，用10 mL 水洗涤小柱，空气吹干柱，用1 mL 含4%甲酸的甲醇溶液以1 mL/min 的流速洗脱小柱，收集液体，取50 μL 进行液相色谱质谱（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC/MS/MS）测定[2]。

1.3.2 标准工作溶液配制

使用甲醇分别将4 种标准品配制成1 mg/mL 的标准贮备液，分别向标准贮备液中加入不同量的甲醇配制成1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL 和50.0 μg/mL 的四环素、土霉素、美他环素标准溶液和2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、40.0 μg/mL 和100.0 μg/mL 的金霉素标准溶液。使用甲醇将内标物地塞米松配制成1 mg/mL 的贮备液，向地塞米松贮备液中加入甲醇稀释至20 μg/mL。

取7支具塞试管，分别加入2 mL牛奶样品及0.1 mL 20 μg/mL 地塞米松内标溶液，再分别加入不同浓度的四环素、土霉素、美他环素标准液各0.1 mL，以及的不同浓度的金霉素标准溶液0.1 mL，分别加入2 mL 水，混合均匀[3]。

1.3.3 液相色谱-质谱分析条件

流动相为甲醇和水，流速为0.5 mL/min；选用电喷雾离子源（ESI+），喷射电压4.2 kV；毛细管温度180 ℃；毛细管电压30 kV；鞘气（N2）流速0.75 L/min； 辅 助 气（N2）流 速0.15 L/min； 扫 描方式为多反应离子监测。采用全扫描一级质谱（FullScanMS）、二级质谱（FullScanMS/MS）测定[4]。

2 结果与分析

2.1 四环素类药物的电喷雾质谱

基于现有研究资料分析，4 种四环素类药物的结构组成见图1，结合4 种四环素药物的分子结构，进行试验检测。经过仪器分析，准分子离子峰[M+H]+质荷比（m/z）结果为四环素为445.4，土霉素为461.2，金霉素为478.9，美他环素为443.2。选择[M+H]+峰进行二级全扫描质谱（MS/MS）分析，产生的碎片离子基峰m/z结果为四环素为427.0，土霉素为443.0，金霉素为461.3，美他环素为426.1。四环素、土霉素及金霉素产生的[M+H-18]+碎片离子为分子脱H2O 形成，但美他环素中的[M+H-17]+碎片离子是分子脱NH3后形成。内标物地塞米松的准分子离子峰m/z为473，其二级质谱m/z为435。

图1 4 种四环素类药物的分子结构

2.2 方法的专属性、线性范围及检测限

将空白牛奶和分别添加1 μg/mL 的土霉素（TC）、四环素（OTC）、金霉素（CTC）和美他环素（MTC）的空白牛奶进行全扫描一级质谱（FullScanMS）、二级质谱（FullScanMS/MS）测定，最终检出结果如图2 所示。基于检测结果分析，牛奶中的内源性物质对四环素类药物的检测不存在影响，不会影响检测结果的精确度。经过线性回归分析，在0.1 ～5.0 μg/mL，四环素标准曲线为y=0.631 9x+0.259 6，r=0.998 3；土霉素标准曲线为y=0.510 3x+0.079 5，r=0.993 9；美他环素的标准曲线为y=0.703 1x+0.203 3，r=0.992 4。在0.2 ～10.0 μg/mL 内，金 霉 素 标 准 曲 线 为y=0.303 9x+0.137 6，r=0.994 9。本实验采用的检测方法对牛奶中四环素类的检出限分别为四环素、土霉素、美他环素均为0.05 μg/mL，金霉素为0.1 μg/mL。

图2 四环素类药物的选择性反应监测色谱图

2.3 回收率和精密度实验

为了研究本次分析实验采用的分析方法对牛奶样品中4 种四环素类药物的实际检测效果，向牛奶样品中分别添加1 μg/mL 的4 种四环素类药物标准品1 mL，经过检测分析，四环素类药物的平均回收率为四环素98.1%、土霉素95.2%、金霉素88.3%和美他环素86.9%。

以相对标准差结果表示精密度，实验过程中分别向2 mL 牛奶样品中添加1 μg/mL 四环素类混合标准溶液1 mL，测定的相对标准偏差为四环素12.2%、土霉素12.8%、金霉素3.2%和美他环素15.0%（n=5）。

3 讨论

在实验检测过程中，正离子检测方式下土霉素、四环素及金霉素的质谱断裂方式相似，存在共同点，即在MS2质谱都优先失去H2O，获得[M+H-H2O]+，在MS3时再进一步丢失NH3，形成[M+H-H2O-NH3]+的碎片离子。但四环素类药物中美他环素质谱断裂规律存在差异，其在MS2时未产生脱水的碎片离子，而是从分子中脱去一个氨分子，产生[M+H-NH3]+离子。从结构来看，美他环素与四环素、金霉素、土霉素存在的主要区别是其在6 位碳原子上没有羟基，而质谱碎片的主要区别是不能产生脱水碎片离子。因此，经过本次检测实验分析，虽然四环素类药物中存在多个羧基，但其是通过脱掉6-羟基才形成MS2的脱水碎片离子。此外，要想充分测定食品中的四环素类药物残留情况，科学处理检测样品也同样重要，以牛奶为例，通常会采用基质固相分散（Matrix Solid-Phase Dispersion，MSPD）法、McIlvaine-EDTA 缓冲液稀释提取法等进行处理，在处理过程中为保证检测效果需对C18柱进行净化处理，需严格遵守相关要求进行操作[5]。

4 结论

综上所述，本文通过应用高效液相色谱质谱联用法开展检测实验，对牛奶中残留的四环素类药物进行检测，结合检测结果，更为全面地分析了高效液相色谱质谱联用法在食品中四环素类药物残留检测中的应用，并分析出食品中四环素类药物残留检测需要注意的事项，希望通过本文研究，为高效液相色谱与质谱联用法的推广应用及进一步发展提供支持。