盐酸多奈哌齐鼻用温敏凝胶在大鼠脑组织内药动学与药效学相关性

黄晶，李爽，樊慧敏，吴春芝，谷福根（1.内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学附属医院，呼和浩特 010050）

阿尔茨海默病（AD）是一种慢性神经退行性疾病，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等症状，严重影响社交、职业与生活功能。皮质胆碱能神经元递质功能紊乱被认为是记忆障碍及其他认知功能障碍的原因之一[1]。盐酸多奈哌齐（donepezil hydrochloride，DPZ）是第二代中枢乙酰胆碱酯酶（AchE）抑制剂，具有药理活性高、选择性强、安全性好等特点，是目前临床治疗轻中度AD 的一线药物[2-3]。盐酸多奈哌齐上市剂型有片剂、胶囊剂等，但口服给药吸收慢，生物利用度低，外周不良反应多，进入脑内药量少，其临床疗效受到限制[4]。鼻腔给药具有吸收快、生物利用度高、脑靶向给药等特点。因此，近年来，国外研究报道，将盐酸多奈哌齐制成纳米混悬液、脂质纳米粒、微乳、脂质体等鼻腔给药新剂型，并初步评价其脑靶向性[5-8]。本文在前期制备盐酸多奈哌齐鼻用温敏凝胶并评价其在动物体内脑靶向性的基础上[9-10]，进一步研究其在大鼠脑组织内药动学与抑制脑组织AchE 活性的药效学之间的相关性。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT 高效液相色谱仪（配备SPD-20A 荧光检测器，日本岛津公司）；AB265-S 型电子分析天平（瑞士梅特勒·托利多公司）；LN 9527-25型高速离心机（德国雅培公司）；TD4C 台式低速离心机（江苏大唐医疗器械有限公司）；721G 可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。

1.2 试药

盐酸多奈哌齐对照品（湖北鸿鑫瑞宇精细化工有限公司，纯度为99.79%，批号：160401）；盐酸多奈哌齐鼻用温敏凝胶剂（自制，批号：20200910，含量：5%）；碘化乙酰硫代胆碱（AThCh，纯度为98%，批号：H21M9F61841）、二硫代双硝基苯甲酸（DTNB，纯度为98%，批号：Y21D9K78215）、谷胱甘肽（纯度为99%，批号：Z17S10C97807）（上海源叶生物科技有限公司）；水杨酸毒扁豆碱（上海摩楷生物科技有限公司）；乙腈（色谱纯，迈瑞达科技有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）；水为超纯水，甲基叔丁醚、盐酸、氢氧化钠等试剂均为分析纯。

1.3 动物

SD 大鼠132 只，SPF 级， 雄性， 体质量250 ～350 g [内蒙古医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（蒙）2016-0001]。

2 方法与结果

2.1 药动学研究

2.1.1 色谱条件[11]色谱柱：Inert Sustain C18（150 mm×4.6 mm，5 µm）；保护柱：WondaSil C18（10 mm×4 mm，5 µm）；流动相：乙腈-0.01 mol·L－1磷酸二氢钠溶液（30∶70）；流速：1.2 mL·min－1；激发波长：325 nm；发射波长：390 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。

2.1.2 脑组织样品的处理[12]将全脑组织用生理盐水清洗干净，用滤纸吸干水分，称定质量，按1∶3 的比例加入生理盐水，在冰水混合浴中采用玻璃匀浆器匀浆，将匀浆液以13 000 r·min－1离心10 min，取上清液100 μL 置于另一EP 管中，加入20 µL 0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液，旋涡混匀，加入300 µL 甲基叔丁醚，旋涡振荡3 min，13 000 r·min－1离心5 min，取上清液200 μL 置于另一EP 管中，40℃水浴中氮气流吹干。残渣用400 μL 甲醇溶解，进样。

2.1.3 专属性考察 分别取大鼠空白脑匀浆、空白脑匀浆加盐酸多奈哌齐对照品、盐酸多奈哌齐鼻用凝胶给药10 min 后的脑匀浆样品各100 μL。按“2.1.2”项下方法处理后进样，记录色谱图[12]。结果在“2.1.1”项色谱条件下，盐酸多奈哌齐保留时间为5.3 min，峰形良好，且无内源性物质干扰。

2.1.4 标准曲线的制备 精密称取盐酸多奈哌齐对照品适量，以水为溶剂，分别配制质量浓度为60.0、300.0、600.0、1200.0、2400.0、3600.0、4800.0 ng·mL－1的系列对照品溶液。取空白脑匀浆100 μL，分别加入系列对照品溶液适量，制备质量浓度分别为10.0、50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0 ng·mL－1的盐酸多奈哌齐标准脑匀浆样品，依照“2.1.2”项下方法处理，进样测定。以脑匀浆中盐酸多奈哌齐的质量浓度（C）为横坐标，其色谱峰面积（A）为纵坐标，作线性回归，得回归方程为：A＝105C＋4888.2（r＝0.9994），表明脑匀浆中盐酸多奈哌齐质量浓度在10.0 ～800.0 ng·mL－1与峰面积线性关系良好。

2.1.5 精密度与回收率考察 配制质量浓度分别为50.0、200.0、600.0 ng·mL－1的盐酸多奈哌齐脑匀浆质控样品，各平行5 份，按“2.1.2”项下方法处理后进样，重复测定5 次，连续测定5 d，计算日内、日间精密度。结果日内与日间精密度RSD均小于5%，表明该方法的精密度良好。同时，将每个质量浓度质控样品测得的药物峰面积（A），代入当日测定的标准曲线方程，计算方法的相对回收率。将上述质控样品对应相同浓度盐酸多奈哌齐水溶液直接进样，测得峰面积（B），以A/B计算方法的提取回收率。结果方法的相对回收率在96.29%～104.28%，提取回收率在97.12%～104.43%，均符合生物样品测定要求。

2.1.6 检测限与定量限的考察 分别配制系列低浓度盐酸多奈哌齐脑匀浆样品，处理后进样，记录色谱图，以信噪比（S/N＝3）作为检测限，S/N＝10 为定量限。测得该方法的检测限为3.3 ng·mL－1，定量限为10 ng·mL－1。

2.1.7 稳定性考察 配制质量浓度分别为50.0、200.0、600.0 ng·mL－1的脑匀浆样品，考察在室温下放置24 h，处理后在进样室放置24 h，冻-融循环3 次，－20 ℃冷冻放置5 d 的稳定性，结果不同质量浓度盐酸多奈哌齐脑匀浆样品的RSD均＜13%，均具有良好的稳定性。

2.1.8 药动学实验 用乙醚麻醉大鼠，切开颈部皮肤，分离食管、气管，行气管插管，并在食管上作一切口，插入一段聚乙烯管至鼻腔后部，手术线固定，用微量注射器吸取盐酸多奈哌齐鼻用温敏凝胶剂，给药剂量为10 mg·kg－1，沿聚乙烯管伸入大鼠鼻腔后部缓慢推入，给药完毕后立即拔出聚乙烯管，将食管结扎。分别于给药3、5、10、20、30、45 min，1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h各处死6 只大鼠。迅速分离全脑组织，于－20 ℃条件下保存，备用。

脑匀浆中盐酸多奈哌齐的浓度见表1。将每个时间点动物脑组织中的药物浓度取均值，绘制脑组织盐酸多奈哌齐浓度均值-时间曲线图，结果见图1。可见，盐酸多奈哌齐鼻用温敏凝胶经鼻给药后，由鼻黏膜吸收进入脑组织的速度很快，tmax约为10 min，Cmax高达10 758.94 ng·g－1，脑药浓度达峰值后，随着时间的延长快速下降。

2.2 药效学研究[13]

2.2.1 脑匀浆样品的制备 取大鼠全脑组织，生理盐水洗净后，用滤纸吸干水分，称定质量，再加3 倍体积0.1 mol·L－1pH 7.4 的PBS 采用玻璃匀浆器在冰水浴条件下匀浆。然后，将脑匀浆液以10 000 r·min－1离心5 min，取上清液置于EP管中，备用。

2.2.2 标准曲线的制备 取1.0 mmol·L－1谷胱甘肽液（双蒸馏水配制）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 置于6 支试管中，均加入0.1 mol·L－1pH 7.4 的PBS 1.0 mL，加蒸馏水至1.5 mL，再加2 mmol·L－1的DTNB 1.0 mL（pH 7.0 的PBS 配制）制成相当于脑组织含0、50、100、150、200、250 U·g－1AchE活性的溶液。以不含谷胱甘肽的样品为空白，用分光光度计于412 nm 处测定样品的吸光度。以样品液的酶活性（E，U·g－1）为横坐标，其吸光度（A）为纵坐标，作线性回归，求得标准曲线方程为：A＝0.0097E＋0.011，r＝0.9984，表明在0 ～250 U·g－1酶活性范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.2.3 脑组织AchE 的测定 取大鼠，给药方法和给药剂量同“2.1.8”项下。分别于给药3、5、10、20、30、45 min 及1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h断头处死，立即分离全脑组织，并制备脑匀浆样品。将每份脑匀浆上清液分为供试管和对照管，两管内各加入上清液100 μL，再在对照管中加入0.1% 水杨酸毒扁豆碱（蒸馏水配制）1 滴，两管各加入pH 7.4 的PBS 1.9 mL，混匀，置37℃水浴中预热5 min，各管加入2.5 mmol·L－1AThCh 底物液（双蒸馏水配制）0.5 mL，混匀，37℃水浴15 min，测定管中加入0.1% 水杨酸毒扁豆碱l 滴以终止反应，最后在两管中各加入 2.0 mmol·L－1的DTNB 溶液0.5 mL，混匀，4000 r·min－1离心15 min 后，分取上清液，以对照管溶液为空白，用可见分光光度计于412 nm 波长处测定吸光度，计算脑组织的AchE 活性，结果见表1。将测得的脑组织AchE 活性取均值对时间作曲线图，结果见图1。可见，盐酸多奈哌齐鼻用温敏凝胶经鼻腔给药后，脑组织中AchE 的活性很快下降，酶活性最低值（Emin）出现在给药后10 min，与脑组织中药物峰浓度的tmax一致。随后，AchE 活性随着脑组织中盐酸多奈哌齐浓度的下降逐渐回升并最终达稳定状态。将大鼠脑组织中盐酸多奈哌齐浓度（Y）与对应相同时间点脑组织中AchE 活性（X）进行回归分析[14-15]，求得回归方程为：Y＝－449.15X＋22 315，r＝0.9652（P＜0.001），表明两者之间成负相关。

图1 盐酸多奈哌齐鼻用温敏凝胶在大鼠脑组织中药物浓度与AchE活性-时间曲线Fig 1 Drug concentration and AchE activity-time curves after the administration of donepezil hydrochloride thermosensitive nasal gel in rats

表1 盐酸多奈哌齐鼻用温敏凝胶剂在大鼠脑组织中药物浓度与AchE 活性(x±s，n ＝4 ～6)Tab 1 Drug concentration and AchE activity in the brain tissues after the administration of donepezil hydrochloride thermosensitive nasal gel in rats (x±s，n ＝4 ～6)

3 讨论

盐酸多奈哌齐治疗AD 主要是通过抑制脑组织内AchE 活性来发挥作用。本文大鼠体内药动学研究结果显示，盐酸多奈哌齐鼻用温敏凝胶经鼻腔给药后，药物进入脑组织的速度很快，tmax仅为10 min，此后脑药浓度快速下降，提示该鼻用凝胶剂中药物释放较快且完全，无缓释长效作用。另外，课题组前期研究已证实，该鼻用凝胶剂亦具有明显脑靶向性[10]。

大鼠体内药效学研究发现，盐酸多奈哌齐鼻用凝胶给药后，在实验的盐酸多奈哌齐浓度范围内，脑组织内AchE 的活性随着药物浓度快速升高而下降，其活性最低值出现时间与脑组织内药物的tmax完全相同，即脑组织盐酸多奈哌齐浓度达峰值时，AchE 的活性最小；在tmax之后，随着脑组织内盐酸多奈哌齐浓度的下降，AchE 的活性逐渐回升并趋于稳定。脑中AchE 活性的变化与脑内盐酸多奈哌齐浓度的变化趋势相反，即药物对脑中AchE 活性抑制效应的大小与脑药浓度变化完全同步，提示无药物滞后效应存在。脑组织AchE 活性与脑药浓度相关性拟合结果显示，相关系数r值大于0.9，斜率为负值，表明盐酸多奈哌齐在脑组织内对AchE 活性抑制作用强弱与其浓度成明显正相关。这一现象，再次证实了盐酸多奈哌齐用于治疗AD 的主要药理机制，对于今后研究开发盐酸多奈哌齐鼻腔途径给药新制剂和预测现上市制剂的临床疗效具有指导作用。另外，作者曾采用DAS3.3.0 药动学软件，尝试对脑组织盐酸多奈哌齐浓度与药效学数据进行PK-PD 结合模型拟合，结果发现两者之间并不符合经典的Sigmoid Emax 模型（Hill 模型）机制[16]。至于采用何种PK-PD 结合模型进行分析比较合适，有待进一步探讨。