施氮量对小麦籽粒淀粉粒的效应

蔡文璐，李 可，简超群，郑路敏，唐树鹏，徐云姬

(1.扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室/扬州大学农业科技发展研究院，江苏扬州 225009；2.江苏省作物栽培生理重点实验室/扬州大学农学院，江苏扬州 225009)

基于小麦穗内籽粒开花日期和粒重的差异，籽粒被分为强势粒和弱势粒。通常强势粒位于麦穗中部，开花早、灌浆快、粒重高；弱势粒位于麦穗的顶部和基部，开花迟、灌浆慢、粒重低。小麦籽粒淀粉是碳储藏物的主要形式，约占其最终干重的70%；淀粉以半晶体状的淀粉粒形式存储于胚乳中，粒径大小分界明显，多呈球体状或透镜体状。一般将成熟小麦的淀粉粒按照粒径分为3种类型: A型淀粉粒(> 9.9 μm)、B型淀粉粒(< 9.9 μm)和C型淀粉粒(< 2.0 μm)。也有研究按照粒径将小麦淀粉粒分为小淀粉粒(< 5 μm)、中淀粉粒(5～50 μm)和大淀粉粒(> 50 μm)。小麦的淀粉粒度分布影响着淀粉的理化特性，进而影响小麦籽粒重量和品质性状。据报道，小麦淀粉粒度分布特征在强、弱势粒间存在显著差异，这种差异与籽粒灌浆期可溶性淀粉合成酶(SSS)和颗粒结合性淀粉合成酶(GBSS)的活性及其相关基因表达密切相关。

籽粒淀粉粒度分布特征由遗传基因和环境条件共同决定。氮肥施用作为最重要的栽培调控措施之一，对小麦籽粒淀粉粒度分布具有重要的调控作用。马冬云等观察到，随着氮肥用量的增加，小麦籽粒中<2.0 μm 和 <9.8 μm 的淀粉粒数量、体积和表面积分布比例呈下降趋势，而>9.8 μm的淀粉粒数量和表面积分布比例呈增加趋势。吴培金等发现，在施氮量210 kg·hm内，增施氮肥可降低弱筋小麦品种A型淀粉粒体积和表面积分布比例，提高其B型淀粉粒体积和表面积分布比例，而对A、B型淀粉粒数量百分比无显著影响。还有学者提出，糯小麦淀粉粒度分布对氮素水平的响应在品种间存在差异。关于施氮量对小麦籽粒淀粉粒度分布影响的报道较多，但是施氮量对小麦强、弱势粒淀粉粒度分布影响的报道甚少。氮肥调控小麦籽粒淀粉粒度分布的机理研究也较为少见。

多胺(polyamines,PAs)是一类重要的植物内源生长调节物质，常见的有腐胺(putrescine,Put)、亚精胺(spermidine,Spd)和精胺(spermine,Spm)，对植物的生长发育、形态建成及其对环境胁迫响应均具有重要的调控作用。在高等植物中，依据PAs存在的形式，又可分为游离多胺(free-PAs)、可溶性结合多胺和非溶性结合多胺。其中，free-PAs在小麦籽粒中含量较高，是一类重要的活性物质。研究表明，增加小麦弱势粒中free-Spd、free-Spm含量或其与free-Put比值可以促进籽粒灌浆、增加粒重，在水稻和玉米上也有类似的发现。我们先前发现，free-Spd或free-Spm参与介导小麦花后土壤干旱对强、弱势粒淀粉粒度分布的调控作用。在轻度土壤干旱条件下，free-Spd或free-Spm可通过增强灌浆期弱势粒的SSS和GBSS活性来增加籽粒的中淀粉粒(5～50 μm)体积和表面积分布比例或抑制大淀粉粒(> 50 μm)形成。但是，小麦籽粒free-PAs是否参与氮肥对小麦籽粒淀粉粒度的影响分布尚不清楚。

本研究拟测定不同施氮量处理下小麦灌浆期强、弱势粒中free-PAs含量、淀粉合成酶(SSS和GBSS)活性和成熟期籽粒粒重、淀粉积累量以及淀粉粒数量、长度、体积和表面积分布比例，分析外源PAs对小麦籽粒内源free-PAs含量、淀粉合成酶活性和成熟期籽粒粒重、淀粉积累量以及淀粉粒度分布比例的影响，旨在探明小麦籽粒free-PAs是否介导施氮量对籽粒淀粉粒度分布的调控效应。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验于2020―2021年在扬州大学农学院试验农场进行。前茬作物为水稻，土壤质地为砂壤土，可耕层含有机质2.04%、碱解氮106.2 mg·kg、速效磷34.2 mg·kg和速效钾 66.6 mg·kg。供试材料为当地2个主推小麦品种扬麦16和扬麦20。大田种植，全生育期设置4个施氮量处理：(1)施尿素折合纯氮120 kg·hm(120N)；(2)施尿素折合纯氮180 kg·hm(180N)；(3)施尿素折合纯氮240 kg·hm(240N)；(4)施尿素折合纯氮300 kg·hm(300N)。2020年11月1日播种，小区面积为28.8 m(6.0 m×4.8 m)，随机区组排列，3次重复。人工条播，行距30 cm，3叶期定苗，留基本苗 225×10株·hm。氮肥按基肥∶分蘖肥∶拔节肥∶孕穗肥=4∶2∶2∶2施用。播种前一次性施过磷酸钙(折合纯磷90 kg·hm)和氯化钾(折合纯钾120 kg·hm)，其余田间管理措施参照当地高产田。

1.2 测定指标与方法

小麦开花期各小区选同一天开花、长势一致的麦穗300个挂牌标记。于花后10 d、20 d和 30 d分别每小区取30个标记穗，剥取强、弱势粒液氮冷冻10 min后放入-70 ℃超低温冰箱保存用于free-PAs含量和淀粉合成酶活性的测定(强势粒是麦穗中部小穗的第1、2位籽粒，弱势粒是穗顶部和穗基部小穗的第3～6位籽粒)。成熟期各小区取标记穗50个，进行强、弱势粒粒重和淀粉含量的测定及其淀粉粒度的分析。

1.2.1 游离多胺含量测定

游离多胺[腐胺(free-Put)、亚精胺(free-Spd)和精胺(free-Spm)]的提取与测定方法参照Flores等方法。称1 g籽粒置于预冷好的研钵中，加5 mL 5%高氯酸研磨至匀浆后放于4 ℃冰箱内2 h，27 000 r·min离心15 min，收集上清液将其苯甲酰化后根据 Tomaso等方法采用HPLC分析free-PAs含量。Put、Spd和Spm作为标准品，1,6-己二胺为内标，重复3次。单位以nmol·gDW表示。

1.2.2 蛋白质含量与淀粉合成酶活性测定

蛋白质含量根据Bradford方法测定。籽粒中可溶性淀粉合成酶(SSS)和颗粒结合性淀粉合成酶(GBSS)活性根据文献[33]的方法进行测定。淀粉合成酶活性的单位为 nmol·mgprotein·min。

1.2.3 淀粉含量测定、淀粉粒提取及其粒度分析

强、弱势粒的直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量的测定按照双波长法进行。

淀粉粒提取与纯化按Peng等和Ji等方法并稍作改进。提取的粗淀粉在70 ℃烘干后过200目筛后为纯淀粉，用激光粒度分析仪进行淀粉粒度分析。取50 mg纯淀粉，加5 mL无水乙醇，混匀后置4 ℃冰箱内2 h(需经常振荡)，吸取2 mL转移至粒度分析仪的装有无水乙醇的分散盒中，测量淀粉粒数量、长度、体积和表面积分布特征。结果分析采用仪器本身自带的软件，以百分数表示。本研究将小麦淀粉粒分为小淀粉粒(< 5 μm)、中淀粉粒(5～50 μm)和大淀粉粒 (> 50 μm)。

1.3 植物生长调节物质调控试验

花后6 d分别喷施2 mM Put、1 mM Spd、1 mM Spm、5 mM MGBG(甲基乙二醛双脒基腙，一种Spd、Spm合成抑制剂)、5 mM MGBG+1 mM Spd于麦穗上。这些外源植物生长调节物质于傍晚连续喷施4 d，每次每穗喷施4 mL，上述各溶液中含0.5%(v/v)Teepol作为表面活性剂。以含相同浓度Teepol的去离子水为对照(CK)。各处理以3 m为一个重复，重复2次。

分别在花后10 d、20 d和30 d测定强、弱势粒中3种free-PAs含量和2种淀粉合成酶活性。在成熟期分别进行强、弱势粒的粒重、淀粉含量测定及淀粉粒度分析。

1.4 数据分析

采用Excel 2010和SPSS 16.0进行数据分析、作图、显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同处理对粒重和淀粉积累量的影响

相同施氮量处理下，两个小麦品种强势粒的粒重、直链淀粉、支链淀粉和总淀粉积累量都显著高于弱势粒(表1)。随着氮肥施用量增加，两个小麦品种强势粒的粒重和淀粉积累量没有显著变化，而弱势粒的粒重和总淀粉积累量呈先升后降的变化趋势，且均以180N处理的值最高(表1)。不同施氮量间比较，弱势粒粒重和总淀粉积累量表现为180N>240N>300N/120N，弱势粒中直链淀粉和支链淀粉积累量分别表现为240N>300N/180N>120N和180N>300N/240N/120N(表1)。不同施氮量对两小麦品种粒重和淀粉积累量影响的趋势一致。

表1 施氮量对小麦成熟期强势粒和弱势粒的粒重和淀粉积累量的影响

2.2 不同处理对籽粒淀粉粒度分布的影响

2.2.1 对淀粉粒数量和长度分布的影响

从表2可知，施氮量对两小麦品种强、弱势粒的小淀粉粒、中淀粉粒的数量和长度分布均没有显著影响；对强势粒的大淀粉粒的数量和长度分布没有显著影响，对弱势粒中大淀粉的数量和长度分布有显著效应。弱势粒的大淀粉粒数量和长度分布比例显著高于强势粒。弱势粒中大淀粉粒数量和长度分布比例均表现为180N<240N<300N/120N。

表2 施氮量对小麦成熟期强势粒和弱势粒的淀粉粒数量和长度分布比例的影响

2.2.2 对淀粉粒体积和表面积分布的影响

施氮量对两小麦品种强、弱势粒小淀粉粒的体积和表面积分布比例无显著影响；弱势粒的中淀粉粒体积和表面积分布比例、大淀粉粒的体积和表面积分布比例显著低于、高于强势粒。随着施氮量增加，弱势粒的中淀粉粒体积和表面积分布比例呈先升后降的趋势，具体表现为 180N>240N>300N/120N，强势粒的中淀粉粒体积和表面积分布比例无显著变化(表3)，这与粒重和总淀粉积累量变化一致。两小麦品种强势粒大淀粉粒的体积和表面积分布比例在不同施氮水平下无显著变化，弱势粒的大淀粉粒体积和表面积分布比例均表现为180N<240N<300N/120N(表3)。

表3 施氮量对小麦成熟期强势粒和弱势粒的淀粉粒体积和表面积分布比例的影响

2.3 不同处理对籽粒游离多胺含量的影响

由图1可知，两小麦品种强势粒的游离腐胺(free-Put)、亚精胺(free-Spd)和精胺(free-Spm)含量在花后10 d和20 d高于弱势粒，在花后30 d显著低于弱势粒。与free-Put不同，灌浆前期强势粒的free-Spd和free-Spm含量显著高于弱势粒。施氮量对两小麦品种强势粒的free-PAs含量和弱势粒的free-Put含量都无显著影响。不同施氮水平下，弱势粒的free-Spd和free-Spm含量表现为180N>240N>300N/120N。

图1 不同施氮量对小麦灌浆期强势粒和弱势粒游离腐胺(free-Put)、亚精胺(free-Spd)和精胺(free-Spm)含量的影响

2.4 不同处理对籽粒淀粉合成酶活性的影响

两小麦品种强势粒的2种淀粉合成酶活性在花后10 d、20 d均显著高于弱势粒，在花后30 d显著低于弱势粒(图2)。随着氮肥增施，弱势粒中2种淀粉合成酶活性先增后降，SSS和GBSS活性分别在180N和240N处理下达最大值，施氮量对强势粒中2种淀粉合成酶活性无显著影响(图2)。施氮量对两小麦品种籽粒淀粉合成酶活性的影响趋势一致。

图2 不同施氮量对小麦灌浆期强势粒和弱势粒可溶性淀粉合成酶(SSS)和颗粒结合性淀粉合成酶(GBSS)活性的影响

2.5 淀粉粒度分布比例与粒重、淀粉积累量、游离多胺含量以及淀粉合成酶活性的相关关系

相关分析表明，小淀粉粒的数量、长度、体积和表面积分布比例及中淀粉粒的数量和长度分布比例与粒重、淀粉积累量的相关均不显著，中淀粉粒的体积和表面积分布比例与粒重、淀粉积累量呈显著(<0.05)或极显著(<0.01)正相关，大淀粉粒的数量、长度、体积和表面积分布比例与粒重、直链淀粉、支链淀粉和总淀粉积累量均呈极显著负相关(表4)。

表4 小麦籽粒淀粉粒度分布比例与粒重、淀粉积累量的相关关系

淀粉粒度分布比例与free-PAs含量和淀粉合成酶活性的相关分析表明，小淀粉粒的数量、长度、体积和表面积分布比例以及中淀粉粒的数量和长度分布比例与free-PAs含量和淀粉合成酶活性的相关均不显著，中淀粉粒的体积和表面积分布比例与free-Spd和free-Spm含量、淀粉合成酶活性呈极显著正相关，大淀粉粒的数量、长度、体积和表面积分布比例与free-Spd和free-Spm含量、淀粉合成酶活性呈极显著负相关(表5)。小淀粉粒的数量、长度、体积和表面积分布比例以及中淀粉粒的数量和长度分布比例与free-Put含量的相关不显著，中淀粉粒的体积和表面积分布比例与free-Put含量呈显著或极显著负相关，而大淀粉粒的数量、长度、体积和表面积分布比例与free-Put含量呈极显著正相关(表5)。

表5 小麦籽粒淀粉粒度分布比例与游离多胺含量、淀粉合成酶活性的相关关系

2.6 籽粒游离多胺含量与淀粉合成酶活性、粒重和淀粉积累量的相关关系

相关分析表明，籽粒free-Put含量与淀粉合成酶活性、粒重和淀粉积累量呈极显著负相关，free-Spd和free-Spm含量与淀粉合成酶活性、粒重和淀粉积累量呈极显著正相关(表6)。

表6 小麦籽粒游离多胺含量与淀粉合成酶活性、粒重和淀粉积累量的相关关系

2.7 植物生长调节物质对籽粒相关指标的影响

喷施Put增加了扬麦16弱势粒的free-Put含量，降低了free-Spd和free-Spm含量；喷施Spd和Spm增加了弱势粒的free-Spd和free-Spm含量；喷施MGBG增加了弱势粒free-Put含量，降低了free-Spd和free-Spm含量，且其对籽粒生理活性的影响会因喷施Spd而消除(表7)。喷施Spd、Spm能显著增加弱势粒的淀粉合成酶活性、总淀粉积累量、粒重以及中淀粉粒的体积和表面积分布比例，降低弱势粒的大淀粉粒体积和表面积分布比例；喷施Put的结果与之相反(表7)。除了MGBG，上述植物生长调节物质对扬麦16强势粒的测定指标无显著影响(数据未显示)。

表7 植物生长调节物质对扬麦16弱势粒相关指标的影响

3 讨 论

小麦粒重的形成主要是淀粉合成和积累的过程。研究表明，小麦不同粒位籽粒或强、弱势粒间的粒度分布存在明显差异。本研究中，两小麦品种强势粒的大淀粉粒数量、长度、体积和表面积分布比例显著低于弱势粒，中淀粉粒体积和表面积分布比例均高于弱势粒；相关分析显示，中淀粉粒的体积和表面积分布比例与粒重和淀粉积累量呈显著或极显著正相关，大淀粉粒的分布比例与粒重和淀粉积累量呈极显著负相关。这与我们之前的研究结果一致。再次表明，增加小麦弱势粒的中淀粉粒体积和表面积或减少大淀粉粒形成有望增加其粒重。

有关施氮量对小麦粒重变化的影响，报道不一。在本研究中，两小麦品种弱势粒的粒重随施氮量的增加呈先增后降的趋势。张 敏等发现，增施氮肥增加了非糯小麦籽粒的B型淀粉粒(< 10 μm)数量占比，而降低了糯小麦籽粒的B型淀粉粒(< 10 μm)占比。马冬云等报道，增施氮肥可降低小麦籽粒小淀粉粒(< 2.0 μm或 < 9.8 μm)的数量、体积和表面积百分比，增加大淀粉粒(> 9.8 μm)的数量和表面积百分比。吴培金等观察到，在施氮0～210 kg·hm范围内，增施氮肥可提高小麦籽粒B型淀粉粒(< 10 μm)的体积和表面积百分比，降低A型淀粉粒(> 10 μm)的体积和表面积百分比。可见，小麦籽粒淀粉粒度分布对氮肥的响应会因品种、施氮量及种植环境等因素的不同而产生明显差异。目前，关于不同氮肥水平对小麦强、弱势粒淀粉粒度分布影响的研究，相对较少。本研究中，随着氮肥增施，两个小麦品种弱势粒的中淀粉粒体积和表面积分布比例及大淀粉粒的分布比例分别呈先升后降和先降后升的变化趋势，而强势粒的淀粉粒度分布比例无显著变化(表3)。这与不同施氮量下强、弱势粒粒重和淀粉积累量的变化趋势基本一致(表1)。说明180N处理(合理施氮)下弱势粒粒重、淀粉积累量的提高得益于中淀粉粒体积和表面积分布比例的增加以及大淀粉粒形成的减少。我们也曾观察到，小麦强势粒的淀粉粒度分布比例在花后不同干旱处理下也未发生显著变化，而其弱势粒的中淀粉粒体积和表面积分布比例以及大淀粉粒的分布比例均发生了改变。说明小麦弱势粒可能具有较强的可调性，而强势粒对环境不敏感。

施氮量对小麦籽粒淀粉粒度分布的调控机制尚不清楚。本研究发现，两小麦品种弱势粒的free-Spd和free-Spm含量随着施氮量的增加呈先升后降的变化(图1)，这与中淀粉粒体积和表面积分布比例的变化趋势一致，与大淀粉粒粒度分布比例的变化相反。相关分析表明，free-Spd和free-Spm含量与中淀粉粒的体积和表面积分布比例呈正相关，与大淀粉粒的分布比例呈负相关，free-Put与淀粉粒度分布的相关性与之相反(表5)。外源喷施Spd或Spm可显著增加小麦弱势粒的中淀粉粒体积和表面积分布比例，降低大淀粉粒的体积和表面积分布比例(表7)。这与我们之前的研究结果相似。Yang等也观察到，喷施Spd可显著增加土壤重度干旱条件下小麦籽粒B型淀粉粒(< 10 μm)的体积和表面积分布比例。此外，许多学者也提出，喷施芸薹素(BR)、赤霉素(GA)或脱落酸(ABA)均能显著影响小麦籽粒淀粉粒度分布。说明合理施氮条件下，小麦弱势粒中free-Spd和free-Spm含量的提高可能是其淀粉粒度分布改善、粒重提高的重要原因。之前我们的研究结果显示，free-Put含量与淀粉粒度分布比例的相关关系不显著。在本研究中，小麦籽粒free-Put含量与中淀粉粒的体积和表面积分布比例呈负相关，与大淀粉粒的数量、长度、体积和表面积分布比例均呈正相关(表5)；喷施Put可促进小麦弱势粒的大淀粉粒形成，且具有降低中淀粉粒体积和表面积分布比例的趋势(表7)。这可能是由供试品种、试验地点和气候条件等差异造成的。籽粒free-Put对淀粉粒度分布的调控作用有待进一步研究。本试验中，两个小麦品种籽粒的free-Put含量对施氮量水平的响应不显著(图1)，推测free-Put不参与介导氮肥对淀粉粒度分布的调控作用。

SSS和GBSS作为淀粉合成过程中的2个重要关键酶，与籽粒淀粉粒度分布的形成密切相关。本研究中，小麦籽粒free-Spd和free-Spm含量与SSS和GBSS活性、粒重和淀粉积累量呈显著正相关(表6)。喷施Spd或Spm可增加扬麦16弱势粒的2种淀粉合成酶活性、粒重和淀粉积累量(表7)。这与我们之前的报道相同。说明合理氮肥条件下，free-Spd和free-Spm可通过增强小麦灌浆期弱势粒中的淀粉合成酶活性来增加中淀粉粒体积和表面积分布比例或减少大淀粉粒形成，进而改善其淀粉粒度分布、提高粒重。关于氮肥对籽粒淀粉粒度分布的作用机理仍需深入研究。

4 结 论

两小麦品种灌浆期弱势粒中free-Spd和free-Spm含量随氮肥施用量的增加呈先增后降的变化趋势，而其free-Put以及强势粒中free-PAs含量对施氮量无显著响应。氮肥水平主要影响两小麦品种弱势粒的中淀粉粒和大淀粉粒；合理施氮量下，弱势粒中free-Spd和free-Spm可通过增强淀粉合成酶活性来改善淀粉粒度分布，进而提高粒重。