基于SSR分析广东罗坑鳄蜥饲养种群的遗传结构

何 南，张小丽， 陈 宁， 陈泽柠， 武正军*

1.珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室(广西师范大学)，广西 桂林 541006；(2.广东曲江罗坑鳄蜥省级自然保护区管理处，广东 韶关 512100；3.广西珍稀濒危动物生态学重点实验室(广西师范大学)，广西 桂林 541006)

遗传多样性是物种演化的物质基础，研究物种遗传多样性可以评估物种的生存潜力，尤其对于濒危物种而言，遗传多样性可作为评价物种存活现状、解释其濒危原因的重要指标[1-4]。研究认为，物种遗传多样性受遗传物质变异的影响[3,5]，并且与有效种群数量的Ne值(物种在每个世代中能成功繁殖个体的平均数)成正相关[6]。当Ne值低于100时，种群遗传变异容易丧失，造成物种绝灭；当Ne值大于1 000时，才能有效阻止有害等位基因在种群中固定；只有当Ne值大于10 000时，才能保障种群具备适应性的遗传变异，维持物种的长期生存[6-7]。Fang等[8]研究大熊猫Ailuropodamelanoleuca在大种群和小种群之间的遗传多样性时发现，较大种群大熊猫比小种群大熊猫具有更高的遗传多样性，大种群大熊猫能在自然界中较好生存，而小种群大熊猫则需要通过人为放归增加种群遗传多样性[8]。此外，地理环境[5]、气候[9]、外来物种入侵[10]、生境破碎化[11]以及人类活动[12]等都会直接影响物种遗传多样性。Liu等[13]研究发现，哲罗鱼Huchotaimen遗传多样性水平较低与环境恶化、过度捕捞导致的近亲繁殖有关；陈蓉等[14]研究表明，受栖息地丧失和狩猎因素的威胁，野生黄颊长臂猿Nomascusgabriellae数量减少，遗传多样性降低。生境破碎化可能会造成种内近亲繁殖，而近亲繁殖是影响小种群遗传多样性水平的主要原因之一[15]。研究表明，近交会增加有害等位基因以及隐性有害基因的纯合概率，出现生存力下降、繁殖适应度降低、死亡率高以及种群遗传多样性快速丧失等近交衰退现象[16-19]。例如，周芸芸[20]研究发现，由于栖息地隔离，神农架川金丝猴Rhinopithecusroxellana在遗传多样性上已经可以划分为3个保护管理单元。

目前，在物种遗传多样性研究领域已经开发出多种标记方法，例如线粒体DNA标记[21]、微卫星(SSR)标记[22]、单核苷酸多态性(SNP)标记[23]以及基因测序[24]等。微卫星又称简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)，是由2～6 bp核苷酸重复叠加所产生的串联重复序列[25-27]，广泛存在于真核生物中[28]。该序列具有多态性[29]、共显性且易于检测等特点[30]。微卫星标记法可以了解物种的亲缘关系、种群的动态以及遗传多样性等信息[31-32]，在非损伤采样的濒危动物研究中应用广泛[33]。在大熊猫Ailuropodamelanoleuca[34]、小熊猫Ailurusfulgens[35]、川金丝猴Rhinopithecusroxellana[36]等濒危物种均有使用。

鳄蜥Shinisauruscrocodilurus隶属鳄蜥科Shinisautidae鳄蜥属Shinisaurus。由于人类的捕捉和栖息地丧失，鳄蜥数量急剧下降，属于我国一级重点保护野生动物[37]。目前，研究主要集中于鳄蜥的数量[38]、形态[39]、病理[40]、肠道微生物[41]等方面，关于人工饲养鳄蜥遗传多样性的研究报道较少。本研究基于微卫星标记分析广东罗坑保护区人工饲养鳄蜥群体的遗传结构，拟阐明当前人工繁育鳄蜥的遗传结构，为鳄蜥圈养群体的复壮以及野外放归工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究的112个鳄蜥个体均为来自广东罗坑鳄蜥国家自然保护区人工饲养的种群。利用无损伤法采集鳄蜥的唾液样本进行实验。具体过程：取一次性医用棉签伸入鳄蜥口腔内部，待棉签上的棉花黏上足够的唾液即刻拿出，转移至装有无水乙醇的离心管内，旋上盖子，置冰箱中-20 ℃保存。

1.2 总DNA提取和微卫星扩增

使用动物唾液DNA提取试剂盒(Qiagen，Germany)提取全基因组DNA。微卫星引物获取以及PCR产物电泳与检测参照贝荣丙[42]的方法进行。

1.3 数据统计与分析

所有鳄蜥SSR位点数据均采用GENEPOP on the web软件进行分析检验，用GenALEx6.502软件分析检验鳄蜥SSR位点的等位基因数(Na)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)，用MEGA 7.0软件基于Nei's遗传距离对罗坑鳄蜥饲养种群的112个个体构建种群邻接进化树(neighbor-joining tree，N-J)。

2 实验结果

2.1 Hardy-weinberg平衡检验

Hardy-weinberg平衡检验可以检测出每个等位基因和等位基因的基因型出现频率以及它们在种群中是否处于平衡状态。对罗坑鳄蜥饲养种群的9个SSR基因位点进行遗传稳定性检测，结果显示所有基因位点的平衡检验系数均大于0.05(表1)，表明种群的等位基因及等位基因的基因型出现频率保持稳定。在9个基因位点中，DC11位点的平衡检验系数最低(0.314)，但并未偏离平衡，其余位点在0.775～0.998，平衡系数较大，表明种群的遗传稳定性较高。

表1 罗坑鳄蜥饲养种群Hardy-weinberg平衡检验

2.2 遗传多样性

分析该饲养群体的遗传多样性，结果见表2。由表可见，罗坑鳄蜥饲养种群在各SSR位点上的等位基因数(Na)在3～17，均值为10。DC2、DC3这2个位点的Na值最小，仅有3个。位点DC9拥有的等位基因数最多，为17个。位点DC4、DC12的Na值与均值相等。DC2、DC3、DC7、DC8、DC9、DC11这6个位点的Na值与均值相差较大，表明这些位点上的等位基因在种群中并非均匀分布。

表2 罗坑鳄蜥饲养种群SSR引物的多态性

此外，9对SSR引物的观测杂合度(Ho)在0.018～0.929，均值为0.629，其中：位点DC2的Ho值最小(0.018)；位点DC11的Ho值最大(0.929)。9对SSR引物的期望杂合度(He)范围为0.018～0.851，均值为0.622，其中：位点DC2的He值最小(0.018)；位点DC12的He值最大(0.851)。总体而言，Ho、He两者的均值较为接近，其中两者的最小值在位点DC2重合且相等，但最大值并不重合，Ho最大值在位点DC11，He最大值则在位点DC12。

2.3 邻接进化树(N-J)的构建

基于Nei's遗传距离对罗坑鳄蜥饲养种群的112个个体构建N-J树进行聚类分析。结果显示(图1)，112个个体首先聚成2个主支系：第一主支系包含3个小支系；第二主支系包含5个小支系。在2个主支系中，第一主支系的个体数量明显少于第二主支系。

图1 基于Nei's遗传距离的罗坑鳄蜥饲养种群个体N-J树

2.4 瓶颈效应

罗坑鳄蜥饲养种群的瓶颈效应检测结果见表3。由表可见，该种群在3种模型中都存在杂合子过剩，并且在TPM和SMM模型中都达到显著水平，表明在这2种模型下，罗坑鳄蜥饲养种群存在显著的瓶颈效应。但在IAM模型下，该种群则不存在瓶颈效应(P>0.05)。

表3 罗坑鳄蜥饲养种群的瓶颈效应检测

3 讨论

3.1 鳄蜥人工饲养种群遗传多样性现状

等位基因数在一定程度上可以反映物种某一点遗传变异在进化过程中的累积情况，位点拥有的等位基因数多，意味着保存了更为丰富的种质资源[43]。在罗坑人工饲养鳄蜥种群9个SSR位点中，平均每个SSR位点等位基因数为12个。其中，单个位点等位基因数最大达到17个，最少为3个。总体看来，除了DC2、DC3这2个位点的等位基因数少于9个，其余7个位点的等位基因数均大于或等于9个。

Hardy-weinberg平衡检验以种群间个体的自由交配为基础，对于自然种群，它们具有相对自由的选择交配对象，所以，Hardy-weinberg平衡检验可以提供关于自然种群中遗传变异和进化过程的基本信息[44]。但对于极其濒危的物种而言，由于可选择的交配对象过少而导致近亲繁殖，致使罗坑鳄蜥饲养种群基因杂合度不足，从而在Hardy-weinberg平衡检验时出现不平衡情况[45-46]。对罗坑鳄蜥饲养种群的9个SSR基因位点进行遗传稳定性检测分析，发现9个基因位点的平衡检验系数均大于0.05，表明在该种群内9个基因位点中各个等位基因及等位基因的基因型出现频率遗传保持稳定，即罗坑鳄蜥饲养种群处于平衡状态。该鳄蜥种群未出现偏离平衡，可能与罗坑饲养种群的个体基数较大，且有时会补充野生鳄蜥个体至饲养种群中有关。

遗传杂合度是某个位点的等位基因杂合度，杂合度越高，表明群体内遗传多样性系数越高[47]。罗坑鳄蜥饲养群体的观测杂合度(Ho)波动范围为0.018～0.929，均值为0.629。期望杂合度(He)波动范围为0.018～0.851，均值为0.622。与其他珍稀濒危动物的遗传多样性相比，例如：窄脊江豚长江口种群N.asiaeorientalis(He为0.733)[48]和川金丝猴Rhinopithecusroxellanae(He为0.626)[49]，罗坑自然保护区人工饲养鳄蜥群体的遗传多样性水平与其差异不大，遗传多样性均贫乏。

3.2 瓶颈效应与种质资源保护

当一个种群经过了“瓶颈”作用后，原群体异质性会大幅度降低，加上遗传漂变作用，等位基因频率的快速变化，甚至会出现某些基因完全消失以及某些等位基因固定[50]。TPM、SMM模型计算结果显示，罗坑鳄蜥饲养种群出现杂合子过剩，即在近期历史上该种群经历了瓶颈效应，但在IAM模型下却显示该种群在历史上并未经历瓶颈效应。相比于其他物种(例如：张枫等[48]研究发现长江口窄脊江豚东亚亚种N.asiaeorientalis仅Wilcoxon test检测的IAM模式下显示该种群可能经历过瓶颈, 其他检测结果均不支持种群经历了近期的瓶颈效应；吴华等[51]对梅花鹿Cervusnippon研究结果表明，东北种群、江西种群在3个突变模型中都表现出显著的杂合度过剩，浙江种群在IAM模型和TPM模型中表现出显著的杂合度过剩，四川种群在3个突变模型中都没有出现瓶颈效应)，本研究2种结果不一致，可能是3种模型的算法不一样或选取的鳄蜥饲养群体间的个体差异以及人为干扰所致。多个研究显示，微卫星数据更符合TPM模型，目前已广泛用于种群数量瓶颈效应的检测[52]。因此，从TPM模型显示结果来看，罗坑鳄蜥饲养种群在近期历史上经历了显著的瓶颈效应(P<0.01)，这可能与鳄蜥种群数十年来因人为捕捉和栖息地快速丧失导致种群数量急剧下降有关。

近亲繁殖在动物种群中较为常见，然而近亲繁殖可降低后代存活率与基因多样性，且同时可能携带大量遗传疾病，是濒危物种数量下降的重要原因之一。以Nei's遗传距离绘制罗坑鳄蜥饲养种群个体N-J树(图1)，结果显示112个鳄蜥个体主要聚成2个主分支，而后分散成若干小支系，各支系内个体亲缘关系接近，第一主支系个体数量明显少于第二主支系个体数量。从个体分支情况来看，2个主支系内的个体大部分具有较近的亲缘关系，在之后的饲养管理中，建议根据N-J树结果制定专门饲养管理措施，将亲缘关系较近的个体分开饲养，避免近亲繁殖，以维持种群的遗传多样性。

4 结语

本研究利用SSR标记法研究罗坑保护区鳄蜥饲养种群中112个个体的遗传多样性与遗传结构，结果显示，当前罗坑保护区内鳄蜥饲养种群的遗传多样性贫乏，且由于经历严重的瓶颈效应，导致低频的等位基因消失。在后续保护管理中，应注意稀有等位遗传型个体的发现；在人工饲养管理中，应注意避免近亲繁殖，最大限度保持鳄蜥现存的遗传多样性。