油菜叶片性状及次生代谢物质与其对黄宽条跳甲抗性的关系及对跳甲解毒酶活性的影响

郝江宁, 常 静, 李 妍, 冯建雄, 李海平

(内蒙古农业大学园艺与植物保护学院, 呼和浩特 010019)

植物外部形态特征对害虫取食具有深远的影响,植食性昆虫对寄主植物的发现和选择包括定向和定位两个行为过程,昆虫的触觉和味觉对其定位和取食选择寄主植物起主要作用,寄主植物的外部形态及挥发性物质在植食性昆虫对寄主植物的定向过程中起着关键性作用[1]。

植物叶片表皮蜡质是植物地上部分与外部环境的分界线,在植物对病原物的有效防御机制中,表皮蜡质被认为是第一道防线[2]。植物叶片上的蜡质结构影响叶片表面的光滑程度,蜡质含量对叶片颜色也会产生一定的影响,从而影响植食性昆虫的寄主选择。Bodnaryk发现蔬菜黄条跳甲Phyllotretacruciferae对光滑卷心菜的为害远大于非光滑型卷心菜[3]。茸毛是植物叶部形态特征之一,茸毛的密度和长短对昆虫附着、取食和产卵有重大的影响。刘奕清等研究茶树叶片茸毛对侧多食跗线螨Polyphagotarsonemuslatus的抗性机制,发现茶树叶片茸毛所形成的机械屏障,使侧多食跗线螨的口针长度达不到取食部位[4]。对蚜虫有抗性的高粱叶片表面茸毛稀且较长[5]。植物的茸毛结构是否能够表现出抗虫性并不是绝对的。

植物次生物质的种类和含量与植物抗虫性也密切相关。目前已知与植物抗虫性相关的植物次生代谢物质包括生物碱、酚类、萜烯类等[6]。植物次生代谢物质具有毒杀、驱避昆虫、使其拒食、抑制昆虫生长发育等作用。张永军等发现,棉花的次生代谢物质缩合单宁能抑制棉铃虫Helicoverpaarmigera的生长发育和取食,并对许多刺吸式口器害虫有明显抗虫效果[7]。陈巨莲等发现,抗虫性小麦品种中单宁酸、总香豆素是其抗麦长管蚜Sitobionmiscanthi的主要次生代谢物质[8]。野生番茄含有的黄酮类化合物可以减少植食性昆虫对叶片的损伤[9-10]。番茄中含有的黄酮对烟粉虱Bemisiatabaci产卵有一定抑制作用,黄酮类含量高的品种对烟粉虱有驱避作用[11]。植物次生代谢物质可以防御植食性昆虫的为害,在植物抗虫机制中起着重要的作用。另一方面,植食性昆虫在与植物的协同进化中形成了以抗氧化酶和解毒酶为基础的代谢机制,应对各种生物胁迫,维持正常的生长发育和繁殖[12]。但关于这些物质对甲虫类的影响研究报道很少。

黄宽条跳甲Phyllotretahumilis是春油菜苗期的主要害虫,对油菜生产危害很大。作者在前期研究中已经筛选出了2个对黄宽条跳甲有抗性的油菜品种‘太空蒙Ⅳ’和‘大黄油菜’,1个感虫品种‘青油14’。在此基础上,本研究主要检测了这几个油菜品种叶片性状及次生代谢物质在对黄宽条跳甲抗虫性中的作用及对黄宽条跳甲解毒酶活性的影响,为未来油菜抗虫育种研究提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试油菜

本试验共选用3个油菜品种,分别为甘蓝型油菜Brassicanapus‘青油14’和‘太空蒙Ⅳ’,芥菜型油菜B.juncea‘大黄油菜’。实验室前期研究工作已经明确‘太空蒙Ⅳ’与‘大黄油菜’为抗黄宽条跳甲品种,‘太空蒙Ⅳ’的抗虫性高于‘大黄油菜’;‘青油14’为感虫品种。

选取健康、饱满的3个品种油菜种子,分别均匀播种于花盆中(直径20 cm)。每盆播种20粒种子。出苗2周后取样。

1.2 供试虫源

黄宽条跳甲成虫采自内蒙古呼和浩特市武川县哈乐镇十字花科杂草独行菜Lepidiumapetalum上。黄宽条跳甲成虫越冬结束后,首先选择发芽较早的独行菜为害,当油菜出苗后转移到油菜上为害。

1.3 试剂及药品

没食子酸标准品，α-乙酸萘酯(α-NA)，α-萘酚，固蓝B盐，毒扁豆碱，牛血清白蛋白(BSA)， 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)，还原型谷胱甘肽(GSH)，Macklin 公司；芦丁标准品和荷叶碱标准品，Sigma化学试剂公司；考马斯亮蓝G-250，Fluka 公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.4 油菜幼苗叶片含水量和蜡质含量测定

油菜叶片含水量测定参照薛俊杰的方法[13]。分别选取3个油菜品种的新鲜幼苗叶片各1 g,放入事先称重的培养皿中,置于80℃烘箱内迅速杀青至重量不再变化,称重后减去培养皿重则为叶片干重,每品种重复3次,以单位鲜叶重计算叶片含水量。

蜡质含量测定参照 Bewick等的方法[14]。分别选取3个油菜品种新鲜幼苗叶片5 g,置于烧杯中,倒入80 mL三氯甲烷浸泡叶片1 min,取出叶片后将溶液置于事先称重的蒸发皿中,在通风柜中使三氯甲烷自然挥发完毕且蒸发皿恒重后称量, 称量后所得数值减去蒸发皿重量即为蜡质重量,每品种重复3次,以单位鲜叶重计算蜡质含量。

1.5 油菜叶片茸毛密度及长度的测定

选取出苗2周的3个品种油菜最顶端叶片各10片,使用奥林巴斯(OLYMPUS) CX21型生物显微镜观察油菜叶片正反面表面茸毛。参照郭广君等的方法[15]测定油菜叶片叶脉两侧对称位置单位面积下的茸毛数量,计算茸毛密度。同时测量茸毛长度。

1.6 油菜次生代谢物含量测定

油菜可溶性单宁含量测定采用Folin-Ciocalteu法[16]。取3个品种油菜叶片各0.5 g制备单宁提取液。吸取0.5 mL提取液置于10 mL试管中,先加入2.5 mL 10倍福林酚稀释溶液,再加入2 mL 7.5%碳酸钠溶液,摇匀,静置30 min,在760 nm处测定吸光度。用单宁酸制作标准曲线,计算可溶性单宁含量。

总酚测定采用Folin-Ciocalteu比色法(FC酚法)[17]。称取3个品种油菜叶片各0.5 g,研磨后放入预冷离心管中,加入0.1 mL 10%三氯乙酸,加无水乙醇定容至5 mL,静置30 min,5 000 g下离心10 min,取上清液待用。取乙醇提取液0.5 mL于25 mL容量瓶中,加入9.5 mL蒸馏水,摇匀,加入FC试剂0.5 mL混匀,在0.5～8 min内加入1.5 mL 20%的Na2CO3溶液,充分混合后定容,30℃避光放置0.5 h,760 nm下测定吸光度,以蒸馏水为空白对照。每个样品平行测3次。以没食子酸为标准品,制作标准曲线。

黄酮含量的测定参考王金亭等的方法[18]。将油菜幼苗放入60℃烘箱中干燥5 h后研磨成粉末,称取油菜粉末10 g加入70 mL 95%乙醇,在60℃超声120 min,静置过夜,过滤后用石油醚作溶剂萃取2次,除去脂溶物。除脂后用旋转蒸发仪浓缩,用40%乙醇定容至100 mL。准确称取2 mL样品液到10 mL具塞试管中,加入40%乙醇溶液约3 mL 及5% NaNO2溶液0.3 mL,摇匀。放置5 min 后加入10%硝酸铝0.3 mL,摇匀;5 min后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL及蒸馏水0.4 mL,摇匀;放置15 min,于510 nm波长下测定吸光度,每个样品平行测3次。以芦丁制作标准曲线,计算黄酮的含量。

生物碱的测定参考蔡永萍的方法[19]。将油菜幼苗放入60℃烘箱中干燥5 h后研磨成粉末。油菜粉末用40%乙醇进行超声波提取,温度为50℃,料液比1∶25(g/mL),提取时间为75 min。取2 mL样品溶液于5 mL容量瓶,加三氯甲烷定容至5 mL,振摇,移至分液漏斗中,准确加入溴甲酚绿缓冲液和0.2 mol/L NaOH各1 mL,摇匀,静置,取澄清的三氯甲烷萃取液在415 nm波长处进行测定,每个样品平行测3次。以荷叶碱为标准品制作标准曲线。

1.7 黄宽条跳甲解毒酶活性测定

黄宽条跳甲羧酸酯酶活性的测定参考Van Asperen 的方法[20]。黄宽条跳甲从田间采回后在实验室用不同品种油菜至少饲养2周。取黄宽条跳甲成虫20头,加入预冷的0.04 mol/L，pH 7.0的磷酸缓冲液1 mL匀浆,匀浆液于4℃,12 000 r/min 离心20 min,取上清液作为酶源备用。根据预试验结果,用预冷的0.04 mol/L，pH 7.0的磷酸缓冲液稀释酶液,向每个试管中依次加入0.9 mL预冷的0.04 mol/L磷酸缓冲液,3.6 mL 3×10-4mol/Lα-乙酸萘酯(含与α-乙酸萘酯1∶1的毒扁豆碱),以及0.1 mL酶液,对照加入缓冲液,30℃水浴振荡反应30 min,加入1.8 mL显色剂终止反应。室温下静置5 min。于600 nm处测其吸光度,重复3次。用α-萘酚制作标准曲线,计算羧酸酯酶的比活力。

谷胱甘肽S-转移酶活性测定采用Habig等的方法[21]。每处理取黄宽条跳甲成虫20头(来源同羧酸酯酶),加入预冷的0.02 mol/L、pH 6.5的磷酸缓冲液1 mL冰浴匀浆,匀浆液于4℃、12 000 r/min离心15 min,上清液即为酶源。活性测定时依次加入0.2 mL 0.03 mol/L谷胱甘肽,0.2 mL 0.03 mol/L CDNB,2 mL 0.02 mol/L磷酸缓冲液,0.15 mL酶液(对照用缓冲液代替)。立即混匀,340 nm下测定5 min内吸光度变化值,计算谷胱甘肽S-转移酶的比活力。

1.8 蛋白质含量测定

参照Bradford的考马斯亮蓝G-250法[22]。以牛血清白蛋白制作标准曲线,计算样品中蛋白质含量。

1.9 数据处理

数据处理均在Excel 2016中计算。试验结果采用One-way ANOVA with Dunnett’s post test方法进行多重比较,处理与对照之间的差异显著性采用t测验,显著水平设α=0.05。

2 结果与分析

2.1 3个品种油菜幼苗叶片含水量和蜡质含量

‘太空蒙Ⅳ’和‘大黄油菜’叶片含水量显著高于‘青油14’(表1)。‘大黄油菜’蜡质含量显著高于其他2个品种,‘太空蒙Ⅳ’和‘青油14’的蜡质含量无显著差异。

表1 3个春油菜品种叶片含水量和蜡质含量1)Table 1 Water and wax contents in leaves of three spring rape varieties

2.2 3个油菜品种叶片茸毛密度和长度

3个油菜品种叶片正反两面茸毛密度和长度均有显著差异(表2)。‘大黄油菜’茸毛密度最大,长度最长;‘青油14’次之,‘太空蒙Ⅳ’最小。

表2 3个春油菜品种叶片正反面茸毛密度和长度Table 2 Pubescence density and length on front and back sides of leaves of three spring rape varieties

2.3 3个油菜品种叶片4种次生代谢物质的含量

3个油菜品种幼苗叶片4种次生代谢物质含量见图1。3个品种间单宁含量无显著差异。‘太空蒙Ⅳ’的生物碱含量(59.5 μg/g)显著高于‘青油14’(56.4 μg/g),而‘大黄油菜’生物碱含量(57.6 μg/g)和‘太空蒙Ⅳ’‘青油14’相比无显著差异。‘太空蒙Ⅳ’总黄酮含量为0.33 mg/g,‘大黄油菜’总黄酮含量为0.31 mg/g,二者之间没有显著差异;‘太空蒙Ⅳ’与‘大黄油菜’的总黄酮含量显著高于‘青油14’(0.24 mg/g)。3个品种油菜总酚含量与黄酮类似,‘太空蒙Ⅳ’和‘大黄油菜’显著高于‘青油14’,‘大黄油菜’和‘太空蒙Ⅳ’间无显著差异。

图1 3个春油菜品种叶片4种次生代谢物质含量Fig.1 Contents of four secondary metabolites in leaves of three spring rape varieties

2.4 取食不同品种油菜后黄宽条跳甲2种解毒酶活性的差异

图2表示黄宽条跳甲取食3种油菜后2种解毒酶活性的变化。其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性差异很大,3个品种间有极显著差异(P<0.01),但羧酸酯酶(CarE)活性无显著差异(P>0.05)。

图2 取食3个春油菜品种后黄宽条跳甲2种解毒酶活性Fig.2 Activities of two detoxifying enzymes of Phyllotreta humilis feeding on three spring rape varieties

3 结论与讨论

植物叶片的形态特征对植食性昆虫的取食影响很大。叶片上的茸毛可以作为抗虫因子干扰昆虫产卵及其对植物的附着和取食,也可以作为保护植物免受外界不利因素干扰的屏障。王艳秋等研究Q型烟粉虱BemisiatabaciQ-biotype对烟草品种的选择性[23],李德伟等在油茶对茶黄蓟马Scirtothripsdorsalis的抗性研究[24]中均发现植物叶背茸毛密度低的品种抗虫性较强。植物叶片光滑不利于昆虫附着为害,相反,昆虫更容易在叶表茸毛多的品种上附着、取食和产卵。本试验也发现,不同抗虫油菜品种,其叶片茸毛密度存在差异,‘太空蒙Ⅳ’抗虫性最强,其茸毛密度最小。但王丽丽等发现,葡萄叶片茸毛密度和葡萄对绿盲蝽Apolyguslucorum的抗性没有显著相关性[25]。综上所述,植物叶片茸毛密度对植物抗虫性的影响可能与昆虫种类、口器、取食部位等有关,不同种类的害虫,其为害方式和口器不同,都可能导致对植物茸毛密度反应的差异,在抗虫性研究中应分别对待。另外,植物叶片茸毛长度对其抗虫性也有一定的影响。常金华等研究高粱对蚜虫的抗性机制时发现，高感蚜材料表面茸毛密度大但长度短,抗蚜材料‘河农16’茸毛密度小,长度大[5]。本试验结果表明,‘太空蒙Ⅳ’的正反面茸毛密度和长度都显著小于其他2个品种,抗虫性最好。但同为抗虫品种的‘大黄油菜’无论是茸毛长度还是密度均与‘太空蒙Ⅳ’存在显著差异,可能是由于‘大黄油菜’属于芥菜型,而‘太空蒙Ⅳ’‘青油14’属于甘蓝型。不同类型的油菜其茸毛密度和长度不同,推测芥菜型‘大黄油菜’抗虫性可能与植物表面茸毛没有特定关系,仅与植物次生代谢物质,防御酶、营养物质等密切相关。

水是植物和昆虫生存的条件,参与植物及昆虫体内的各种生理代谢。郑文静等研究水稻主要养分对灰飞虱Laodelphaxstriatellus取食选择性的影响,发现水稻含水量与灰飞虱的选择负相关[26]。薛俊杰研究发现,水稻对稻纵卷叶螟Cnaphalocrocismedinalis的抗虫性随叶片含水量减少而增强,水稻叶片含水量与其抗虫性具有负相关性[13]。而曾粮斌等在研究苎麻叶片主要化学成分与其抗苎麻夜蛾Cocytodescoerulea的关系时发现,叶片含水量与抗虫性没有明显的相关性[27]。本研究发现,不同品种油菜含水量差异显著,‘太空蒙Ⅳ’和‘大黄油菜’叶片含水量高抗虫性强，而‘青油14’叶片含水量低抗虫性弱，油菜叶片含水量高可能对黄宽条跳甲抗性强，但还需要进一步确定。由于不同品种植物、昆虫体内含水量不同,植物含水量对抗虫性的影响可能因植物种类和昆虫种类而异。油菜在内蒙古西部主要种植在干旱少雨地区,因而油菜叶片含水量高抗逆性相对较强,所以抗虫性也相对较高。但关于含水量对油菜抗黄宽条跳甲的影响还需要做进一步深入研究。

植物叶片表面的蜡质含量与其抗虫性紧密相关[28]。 Bodnaryk等研究十字花科植物叶片蜡质与蔬菜黄条跳甲的取食关系,结果表明，叶片具有蜡质层的植物可以更好地抵御蔬菜黄条跳甲的为害[3]。王亓翔等的研究表明,水稻叶片蜡质含量高对稻纵卷叶螟的抗性强[29]。Bergman等认为,蜡质数量的增加会增强紫花苜蓿对苜蓿彩斑蚜Therioaphismaculatus的抗性[30]。本研究结果表明,‘大黄油菜’叶片蜡质含量显著高于其他两个品种,与他们的研究结果一致。但抗虫性更强的‘太空蒙Ⅳ’却与非抗虫品种‘青油14’的蜡质含量相近,且无显著差异,可能是因为‘太空蒙Ⅳ’和‘青油14’都属于甘蓝型油菜,蜡质含量相对芥菜型油菜较低,抗虫性与其叶片蜡质含量没有直接关系。很多研究也表明植物叶片蜡质含量与抗虫性无关[15,31]。植物抗虫性除与叶片蜡质含量有关外,和蜡质的化学成分、结构等也有关系,而且蜡质可能与其他因素一起对植物抗虫性起作用。

植物在与害虫的长期协同进化过程中,为了防御害虫的侵害,会产生一些对害虫不利的次生代谢物质。王丽艳等的研究发现,抗虫水稻品种次生物质含量显著高于感虫水稻品种[32]。Demissie等发现酚类物质含量高的玉米品种受麦蛾SitotrogacerealellaOlivier为害程度减轻[33]。单宁是植物产生的最丰富的次生代谢物,其分子结构上的羟基能和其他蛋白质上的羟基结合使昆虫消化酶活性降低,影响植食性昆虫对食物的利用。辣椒叶片中单宁含量与辣椒对西花蓟马Frankliniellaoccidentalis的抗性呈正相关[34]。左彤彤等的研究发现,不同地理源的红松球果和韧皮部的单宁、黄酮和总酚含量不同,3种次生物质含量与其受到球果尺蛾Eupitheciaabietaria和果梢斑螟Dioryctriapryeri的为害率呈现负相关[35]。单宁能与昆虫唾液蛋白和消化酶结合,降低植物适口性,阻碍昆虫对寄主植物营养物质的消化和吸收[36]。本研究中,抗虫品种‘太空蒙Ⅳ’和‘大黄油菜’的总酚和黄酮含量显著高于感虫品种‘青油14’,‘太空蒙Ⅳ’总生物碱含量显著高于感虫品种‘青油14’。单宁的含量也是‘太空蒙Ⅳ’>‘大黄油菜’>‘青油14’。这些研究结果说明,植物次生代谢物质含量与植物抗虫性之间有直接的关系,植物次生代谢物质的含量,在一定程度上可以反映植物的抗虫性水平。

另一方面,植食性昆虫为分解代谢植物体内的物质和外源有毒物质,形成特有的解毒代谢机制,这是昆虫与所取食植物长期共同进化的结果。昆虫通过调节体内解毒酶活性来代谢次生代谢物质,解毒酶活性的变化是昆虫一种主动的适应机制[37-38]。陈德霞等在研究牧草次生代谢物对亚洲小车蝗Oedaleusasiaticus解毒酶活性影响中发现,取食次生代谢物质(黄酮、生物碱、萜类、酚类和单宁)含量高的牧草,亚洲小车蝗解毒酶活性高,取食次生代谢物质含量低的亚洲小车蝗解毒酶活性也低[12]。牟少飞等研究B型烟粉虱B.tabacibiotype B发现,食物中低剂量的槲皮素会导致烟粉虱CarE和GST的活性显著升高[39]。本试验中,黄宽条跳甲取食3个不同品种油菜后2种解毒酶活性有差异。黄宽条跳甲取食‘太空蒙Ⅳ’和‘大黄油菜’2个抗虫品种后GSTs的活性高于取食‘青油14’,三者间有极显著差异。黄宽条跳甲取食2个抗虫品种油菜后CarEs活性比取食感虫品种油菜的CarEs活性高,但差异不显著。这一试验结果可能与不同品种油菜次生代谢物质含量不同有关,抗虫品种油菜‘太空蒙Ⅳ’和‘大黄油菜’的4种次生代谢物质含量都高于感虫品种‘青油14’。黄宽条跳甲取食不同含量次生代谢物质的油菜后,通过调节2种解毒酶活性来完成解毒代谢。

油菜是我国最重要的油料作物之一,近几年主要面临生产成本高、种植效益低的问题[40],病虫害的危害加剧也给油菜产业发展带来一定的不利条件[41]。研究油菜对苗期主要害虫黄宽条跳甲的抗性机制,减少害虫为害带来的损失,同时减少化学农药的使用,降低生产成本,对未来油菜的绿色可持续发展具有一定的科学指导意义。