向日葵链格孢的分类研究

魏 昕, 查晴辰, 杨姝祺, 刘丰银, 赵 林, 邓建新*

(1. 长江大学农学院, 荆州 434025; 2. 福建农林大学植物保护学院, 福州 350028)

油葵HelianthusannuusLinn.是菊科向日葵属的一年生高大草本植物,为世界第二大油料作物。葵花籽可压榨出低胆固醇的高级食用葵花油。由于其中含有66%的亚酸油,被誉为21世纪“健康营养油”[1]。此外,榨油后剩余的残渣是很好的蛋白质饲料。油葵的种植成本低,管理简单,产量高,含油量好,抗逆性强,已作为特色油料作物被纳入我国重点种植产业中,目前陕西省已拥有大量油葵示范基地[2-3]。并且,油葵的经济价值越来越受重视,市场需求进一步提升。然而,在大面积种植油葵时,病害发生的可能性增高,若防治不当,会造成巨大经济损失,所以对其病害的监测、鉴定、预防和防治尤为重要。

油葵常见的病害有菌核病、黑斑病、褐斑病、叶枯病、霜霉病等[4]。其中黑斑病在油葵种植区普遍发生,主要病原菌为链格孢Alternariaspp.,该菌危害花盘、茎和叶等多个部位,对油葵产量造成极大损失,一般年减产10%～20%,严重时减产可达50%以上,甚至绝收[5]。目前世界上已报道与向日葵黑斑病相关的链格孢共有11种,为链格孢Alternariaalternata、红花链格孢A.cathami、向日葵链格孢A.helianthi、侵染向日葵链格孢A.helianthinficiens、A.heliophytonis、白花菊链格孢A.leucanthemi、A.protenta、A.roseogrisea、细极链格孢A.tenuissima、瘤链格孢A.tuberculata和百日菊链格孢A.zinniae。中国已报道的有7种,包括A.alternata、A.helianthi、A.helianthinficiens、A.leucanthemi、A.tenuissima、A.tuberculata和A.zinniae,其中向日葵链格孢A.helianthi为优势种[6]。向日葵链格孢首次由Hansford于1943年在乌干达发现,并命名为Helminthosporiumhelianthi[7],1969年Tubaki将其更名为A.helianthi[8]。目前世界各地,如印度、日本、中国、美国等国均有报道[9]。

本研究从陕西省华阴市油葵叶片黑斑病样品上分离纯化得到病原菌菌株,检测其致病性,并从形态学和分子生物学特征进行鉴定,明确其种类及分类地位,为向日葵黑斑病病原菌的分类研究及防治提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试菌种来源

2017年9月于陕西省华阴市采集油葵叶斑病病害样本,切取病健交界处组织,利用保湿培养的方法进行单孢分离[10]。将纯化后的菌种编号并保存于长江大学植物病理学实验室。致病性检测后,选取YZU 171766和YZU 171770进行后续研究。

1.1.2培养基

PDA:马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth,Difco,USA)24 g,琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL。

PCA: 马铃薯20 g,胡萝卜20 g,蒸馏水1 000 mL。

1. 2 试验方法

1.2.1形态学鉴定

菌落形态:供试菌株在PDA上培养3～5 d后,在菌落边缘取3个菌龄一致的菌丝块接种于直径90 mm的PDA培养基上(呈正三角分布),在25℃黑暗条件下培养7 d,描述菌落形状,颜色等,并测量菌落直径。

孢子形态:取少量菌丝接种于PCA上,在22℃,L∥D=8 h∥16h的条件下培养7 d[11]后观察产孢表型和分生孢子形态等,并随机选取50个分生孢子进行测量。

1.2.2分子系统学鉴定

供试菌株在PDA上培养5～7 d后,刮取适量菌丝体至1.5 mL离心管中适当研磨,然后采用改良CTAB法提取DNA[12]。以提取的DNA为模板,对供试菌株YZU 171766和YZU 171770的ITS (ITS5/ITS4)[13]和LSU(LROR/LR5)[14]基因进行PCR扩增。采用25 μL的反应体系,含2×TaqPCR StarMix(北京擎科生物科技有限公司)21 μL,DNA模板2 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL。扩增条件为95℃预变性3 min；94℃变性40 s,(ITS: 55℃;LSU: 50℃)复性1 min,72℃延伸1 min,32个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用含有1%核酸染料(Golden View,北京博迈德基因技术有限公司)的琼脂糖凝胶进行电泳检测,将目的条带产物进行正反引物测序(北京擎科生物科技有限公司)。

利用BioEdit软件对测序成功的序列进行校对，获得完整序列。登录NCBI网站利用BLAST进行同源性比对分析,找出相似性最高的菌株,在GenBank数据库或参考文献中选取模式菌株或代表菌株作为参考(基因登录号见表1),确保所构建系统发育树的准确性。利用jPHYDIT[15]软件对所选参考序列与本研究序列进行比对,并在MEGA 7.0[16]软件中对两个基因序列进行拼接合并,最后利用RAxML[17]软件进行最大似然法分析(maximum likelihood:ML)并构建系统发育树,利用GTRCAT模型计算1 000次分析获得bootstrap支持率(BP)。

1.2.3致病性检测

供试菌株在PCA上产生分生孢子后,利用无菌水洗脱分生孢子,过滤离心,再配制成浓度为5×105个/mL的孢子悬浮液。取20 μL的孢子悬浮液滴于干净健康的油葵叶片中心(株龄30～60 d,株高30～40 cm),以无菌水作为对照,置于保湿装置中培养,每天观察并记录发病情况,每个菌株设3个重复。对发病部位的病原菌进行再次分离,并与原分离物进行比对,完成科赫式法则验证。上述试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 油葵黑斑病危害症状及致病性检测

油葵黑斑病可危害向日葵多个部位,主要以叶片为主,从下部叶片开始发病并逐渐向上部蔓延。受害叶片常见圆形或不规则的黑褐色病斑,病斑周围常伴有亮黄色晕圈,条件适宜时病害发展迅速,后期病斑连成大片导致整个叶片枯萎死亡(图1a)。该病也可发生在叶片和叶柄相连部位,直接导致叶片枯萎,最终脱落。

将供试菌株的分生孢子悬浮液接种于健康的油葵叶片后,第3天接种部位出现褐色的小斑点,随后逐渐扩大,病斑呈黑褐色圆斑,中央呈灰白色,边缘有少量黄色晕圈,接种点略有皱缩,与田间发病症状一致。7 d后测量病斑直径,菌株YZU 171766所致病斑直径一般为8.5～16.5 mm,少数可达20 mm,菌株YZU 171770病斑直径8.0～13.5 mm。两菌株所致症状相似(图1),YZU 171766引起症状略显严重。从叶片发病部位分离获得的病原与原接种物一致,表明分离物为油葵黑斑病病原菌。

图1 油葵黑斑病田间症状及致病性检测Fig.1 Symptom of black spots on Helianthus annuus in the field and pathogenicity tests

2.2 形态学

两株病原菌YZU 171766和YZU 171770菌落生长均缓慢,菌落直径较小,产孢量较为丰富,而菌落形态和孢子形态略有不同，其中YZU 171766的菌落生长速度较快,分生孢子较短。

菌落形态:在PDA上培养7 d,菌株YZU 171766(图2a)菌落白色,气生菌丝毛毡状,培养基表面形成致密的菌落,中央突起,向外延伸，扁平,边缘不规则,背面颜色偏灰白,直径15～16 mm。菌株YZU 171770(图2e)菌落呈灰色,在培养基表面形成致密的菌落并结块,质地偏硬,难以戳破,中央突起,周围扁平,反面深灰色偏深绿色,边缘白色,菌落直径5～6 mm。

孢子形态:在PCA培养基中培养7 d,分生孢子梗单生,直立或略弯,浅黄褐色近无色,分隔,基部略微膨大。菌株YZU 171766分生孢子梗(15～75)μm×(5～9)μm,有0～3个隔膜(图2b,c);菌株YZU 171770分生孢子梗(20～44)μm×(5～9)μm,有0～4个隔膜(图2f, g)。分生孢子单生或链生两个孢子,直立或稍微弯曲,圆柱状、长椭圆形,初期无色,后颜色逐渐成淡黄褐色,两端钝圆且无喙,有隔处略微缢缩,有明显的脐点。菌株YZU 171766分生孢子(29～119)μm×(8～31)μm,有3～10个横隔膜,0～3个纵斜隔膜(图2d)。菌株YZU 171770分生孢子(42～179)μm×(14～37)μm，有3～12个横隔膜,0～4个纵隔膜(图2h)。

图2 向日葵拟链格孢菌株YZU 171766和YZU 171770的菌落和分生孢子形态特征Fig.2 Colonies and conidial morphology of Alternariaster helianthi YZU 171766 and YZU 171770

2.3 系统发育分析

供试菌株YZU 171766和YZU 171770的ITS和LSU基因序列在NCBI网站进行同源性比对后发现,其与已报道的向日葵拟链格孢Alternariasterhelianthi(曾用名:向日葵链格孢Alternariahelianthi)的一致性均达99%以上。将ITS和LSU基因序列拼接合并后总共有1 120个碱基(ITS含547个,LSU含573个)。借助GenBank数据库和参考文献选取31个相关菌株(分别来自5个不同的科)进行系统发育分析(表1),最大似然法构建的系统发育树见图3,节点处显示最大似然法分析支持率(BP)≥60%的数据。

表1 构建系统发育树的菌株信息及GenBank登录号Table 1 Strains and their GenBank accession no. used in the phylogenetic analysis

续表1 Table 1(Continued)

在构建的ML系统发育树中,供试菌株YZU 171766和YZU 171770与向日葵拟链格孢Alternariasterhelianthi聚为一簇(BP=99%),其中YZU 171770与CBS 134018等5个菌株形成一个聚类分支(BP=68%), 而YZU 171766呈现在不同的分支上。通过比对,两个菌株的LSU基因序列完全相同,ITS基因序列有2个碱基不同。通过5个相关的科(小球腔菌科Leptosphaeriaceae、盾壳霉科Coniothyriaceae、葫芦霉科Cucurbitariaceae、亚隔孢壳科Didymellaceae、格孢腔菌科Pleosporaceae)构建系统发育树,结果显示拟链格孢属Alternariaster属于小球腔菌科,不属于格孢腔菌科。拟链格孢属的3个种Alternariasterhelianthi、Al.bidentis和Al.centaureae-diffusae聚于一支,BP为100%。其中Al.helianthi和Al.bidentis的亲缘关系更近,聚为一支(BP=99%)。而与Al.helianthi形态相似的白花菊链格孢Alternarialeucanthemi与链格孢Alternariaalternata聚为一支(BP=100%),属于格孢腔菌科的链格孢属Alternaria,与小球腔菌科系统发育关系较远。

3 结论与讨论

2003年,张天宇在《中国真菌志:链格孢属》中对向日葵链格孢Alternariahelianthi进行了详细的描述[19]。该菌与白花菊链格孢Alternarialeucanthemi同为向日葵的重要病原菌,形态学上较为相似,可形成单生,直立,无喙,蠕虫状的分生孢子,孢子横径和横隔膜数作为其区分依据[19]。白花菊链格孢的寄主有马兰Asterindicus[6]、大滨菊Leucanthemummaximum[11]和向日葵[18-19],分生孢子长度<100(～120)μm,横径<25 μm,横隔膜数最多可达17个(表2)。向日葵拟链格孢的寄主只有向日葵,分生孢子长度最大可达179 μm,横径可达41 μm,横隔膜数最多可达12个(表2)。由此可见,向日葵拟链格孢与白花菊链格孢相比,其分生孢子主横隔少、鲜见增厚,孢身较长,横径较宽,且孢壁颜色更淡。然而,它们形态和产孢表型都与Alternaria的其他种有较大差别,其分类地位一直以来都未引起人们的重视,张天宇等[20]建议应将二者独立为新属。2007年Simmons对链格孢属的形态学进行详细系统的分类研究后,发现向日葵链格孢菌中不存在像链格孢菌中常见的显著且颜色较深的环痕(分生孢子梗产孢细胞的产孢孔和分生孢子基部细胞的着生点),并置于新属拟链格孢属Alternariaster,更名为Alternariasterhelianthi[11]。本研究利用形态学将所分离的油葵黑斑病病原菌鉴定为向日葵拟链格孢Alternariasterhelianthi。

基于ITS和LSU基因序列分析,向日葵拟链格孢与链格孢属的系统学关系较远(图3)。链格孢属真菌属于子囊菌的格孢腔菌科,而向日葵拟链格孢属于小球腔菌科。此结果进一步从分子系统学上证明了Simmons[11]形态学结果,原称为向日葵链格孢Alternariahelianthi应属于拟链格孢属Alternariaster真菌,为Al.helianthi的曾用名。本研究结果与Alves等[18]和Woudenberg等[21]的结果一致。由于缺乏参考菌株,且形态学重要可区分特征认识不足,小球腔菌科Leptosphaeriaceae的分类研究一直存在一定的问题[20]。Alves等[18]于2013年首次报道Alternariaster属的另一个新种Al.bidentis,分生孢子孢身较短(50～98 μm),横径较窄(<20 μm),容易与Al.helianthi区分开来。此外,Al.bidentis的分生孢子没有斜或纵隔膜,在菌落上可观察到性孢子器(spermogonia),而Al.helianthi没有这些现象。至此,Alternariaster属共包含两个种Al.helianthi和Al.bidentis,且均未观察到有性态特征。随后,Ariyawansa等[22]在矢车菊Centaureadiffusa枯死的茎上发现了一个有性态新种Al.centaureae-diffusae,但未观察到其无性态特征。到目前为止Alternariaster属共包含上述3个种类。向日葵链格孢Alternariahelianthi国际上虽已更名为Alternariasterhelianthi,但我国仍在延续使用前者,为了避免造成国内后期分类混乱,本研究中从形态学和分子系统学两方面对其进行分析研究,将该菌命名为向日葵拟链格孢Alternariasterhelianthi,以期在未来能科学地统一起来。

图3 基于ITS和LSU基因序列利用最大似然法构建的油葵黑斑病病原菌系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of the pathogenic fungus causing black spots on Helianthus annuus based on ITS and LSU gene sequences using maximum likelihood

我国对向日葵黑斑病的研究主要集中在20世纪80年代,近十年来,国内外对油葵黑斑病的研究报道极少,2014年我国学者发现向日葵黑斑病病原菌大部分是Alternariaalternata,而未发现其优势种Alternariasterhelianthi[23]。可见,向日葵黑斑病的优势病原可能发生变化,急需进行多方面的调查研究[24]。然而,由于其菌落生长速度缓慢,在组织培养中很容易被其他生长速度快的真菌覆盖(如Alternariaalternata),而不容易被观察到,建议使用保湿培养的方法进行观察和分离[10]。此外,本研究结果表明在形态学上Alternariasterhelianthi种内存在一定的差异性。菌株YZU171766在菌落大小、颜色和分生孢子长宽均与YZU 171770不同,然而两株菌对油葵的致病力差异不大,该结果为向日葵黑斑病的病原学和防控等相关研究奠定了基础。