UPLC-MS/MS检测长白山白眉蝮蛇蛇毒中的类凝血酶

咸瑞卿 ，王聪聪，巩丽萍，张迅杰，彭 丽，石 峰*

（1. 山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室，山东省仿制药一致性评价工程技术研究中心，山东 济南 250101；2. 山东大学 药学院，山东 济南 250012；3. 华润双鹤利民药业（济南）有限公司 质量部，山东 济南 250200）

蛇毒是由蛇的毒腺分泌的一种天然蛋白质，含多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物学活性[1-4]。蛇毒类凝血酶（thrombin-like enzyme，TLE）是蛇毒中与凝血酶作用机制部分相似的一类蛋白水解酶，属丝氨酸蛋白酶，能水解纤维蛋白原为纤维蛋白，具有体外促凝、体内降纤的作用，因其具有重大临床应用价值而被广泛研究[5-6]。目前国内获批上市的蛇毒类凝血酶药物有多种，其中注射用白眉蛇毒血凝酶（邦亭）、注射用矛头蝮蛇血凝酶（巴曲亭）等是临床广泛使用的止血药，占止血药市场份额近50 %[7-9]。但不同蛇种来源的类凝血酶结构不同，其作用机制不同，相应的药理作用也存在差异[10]，因此明确蛇毒类凝血酶蛇种来源对于该类产品的质量控制，保障临床用药的安全有重要作用。

现报道的蛇毒种属鉴别及其类凝血酶检测方法主要为酶联免疫吸附测定（ELISA）[11]、液相色谱法和电泳法等[12]，存在方法繁琐、专属性差等问题。随着蛋白质组学技术的发展，基于液相色谱串联质谱技术的物种特征肽检测已逐渐成为食品药品质量控制的重要方法[13-14]。本研究基于长白山白眉蝮蛇类凝血酶特征肽，建立了一种专属性强、灵敏度高的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），用于检测长白山白眉蝮蛇的蛇毒种属来源及类凝血酶含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AB SCIEX Triple Quad 6500+型超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）；CP225D电子天平（德国Sartorius公司）；Sigma 3-30 K冷冻离心机（德国Sigma公司）；Milli-Q Advantage A10超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，美国Honeywell公司）；甲酸（色谱纯，美国ACS恩科化学公司）；胰蛋白酶（效价≥10 000 IU/mg）；碘乙酰胺（分析纯，美国Sigma公司）；三羟甲基氨基甲烷（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；二硫苏糖醇（纯度：≥99 %，上海翌圣生物科技有限公司）；特征肽（TLCAGVMEGGIDTCNR）对照品（纯度：≥98 %，上海强耀生物科技有限公司）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

长白山白眉蝮蛇蛇毒（编号：S1～S3，锦州奥鸿药业有限责任公司）；矛头蝮蛇蛇毒（编号：S4～S6，蓬莱诺康药业有限公司）；长白山白眉蝮蛇类凝血酶（批号：201429，锦州奥鸿药业有限责任公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样量：2 μl；流速：0.2 ml/min；流动相A为0.1 %甲酸水溶液，流动相B为0.1 %甲酸乙腈，梯度洗脱，洗脱程序：0→1 min， 流动相B 20 %；1→3 min，流动相B 20 %→60 %；3→6 min，流动相B 60 %。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；以m/z877.4（双电荷）→892.4为定量离子对，以m/z877.4（双电荷）→550.2为定性离子对；离子源温度：500 ℃；离子化电压：5.5 kV；碰撞室出口电压：10 V；入口电压：10 V；碰撞能量：45 eV，去簇电压：135 V。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取特征肽对照品10 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取0.1，0.25，0.5，1，2 ml，分别置100 ml量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀；分别精密量取200 μl，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μl，混匀，60 ℃反应60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μl，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μl和0.4 mg/ml胰蛋白酶水溶液（临用新制）10 μl，37 ℃反应90 min，90 ℃酶解10 min，放冷至室温，12 000 r/min离心10 min，取上清作为系列对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取待测样品20 mg，置10 ml量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并定容；精密量取200 μl，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μl，混匀，60 ℃反应60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μl，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μl和0.4 mg/ml胰蛋白酶溶液（临用新制）10 μl，37 ℃反应90 min，90 ℃酶解10 min，放冷至室温，12 000 r/min离心10 min，取上清作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 精密量取25 mmol/L碳酸氢铵溶液200 μl，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μl，混匀，60 ℃反应60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μl，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μl和0.4 mg/ml胰蛋白酶溶液（临用新制）10 μl，37 ℃反应90 min，90 ℃酶解10 min，放冷至室温，12 000 r/min离心10 min，取上清，即得阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液和空白溶液（25 mmol/L碳酸氢铵溶液），按2.1项下色谱质谱条件进样测定，MRM色谱图见图1。结果显示阴性样品溶液、空白溶液在对照品溶液出峰位置没有干扰峰出现，供试品溶液在相应保留时间处峰形良好，表明该方法专属性良好。

图1 专属性考察MRM图谱

2.3.2 线性及范围 按2.2.1项下方法制备终浓度为20，50，100，200，400 ng/ml的系列对照品溶液，按2.1项下色谱质谱条件进样测定。以系列对照品溶液中特征肽的浓度（x，ng/ml）为横坐标，以对应的峰面积（y）为纵坐标，计算得线性回归方程：y=783.41x-10 329（r=0.9990），在20～400 ng/ml范围内，特征肽的浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验 精密称取编号S1的蛇毒样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱质谱条件测定，连续进样6次，结果显示保留时间和峰面积的RSD均＜2.6 %，表明该法精密度良好。

2.3.4 重复性试验 精密称取编号S1的蛇毒样品6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱质谱条件测定，结果显示，6份样品的保留时间和峰面积的RSD均＜2.5 %，表明该法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取2.2.2项下供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，16，24 h进样测定，结果显示，各时间点保留时间和峰面积的RSD均＜3 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.6 检出限与定量限 取2.2.1项下20 ng/ml对照品溶液，用空白溶液稀释制备不同浓度的溶液。当浓度为2 ng/ml和6 ng/ml时，对应的峰高信噪比分别为3.4和11.8，因此检出限为2 ng/ml，定量限为6 ng/ml。

2.3.7 加标回收试验 精密称取已知特征肽含量的蛇毒样品（S1，含量530 ng/kg）19.80 mg，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并稀释至10 ml；取9份，每份200 μl，各加入适量特征肽对照品溶液，按2.2.2项下方法制备回收率考察溶液，以m/z877.4（双电荷）→892.4作为定量离子对，进行检测。结果显示3个水平的回收率均在91.2 %～107.8 %范围内，平均回收率96.2 %，RSD为6.6 %，该方法回收率良好。见表1。

表1 加标回收试验结果（n=3）

2.4 样品测定

采用本方法对收集到的6批蛇毒样品进行测定。结果显示在以m/z877.4（双电荷）→892.4和m/z877.4（双电荷）→550.2离子对提取的供试品溶液离子流色谱中，S1～S3样品均呈现与对照特征肽色谱保留时间一致的色谱峰，而S4～S6样品在对照特征肽色谱保留时间处均未提取到色谱峰。因此，编号为S1～S3的3批蛇毒中均可检测到特征肽TLCAGVMEGGIDTCNR，确认其来源于长白山白眉蝮蛇，而另外3批蛇毒均未检测到该特征肽，因此为非长白山白眉蝮蛇来源。对于检测到特征肽的3批样品，用回归方程计算供试品溶液特征肽的含量，结果见表2。由表2可见，特征肽含量为474～530 mg/kg。

表2 样品测定结果

3 讨论

特征肽的选择是采用液相色谱串联质谱进行蛋白质定性定量分析的关键和难点，直接决定了后续建立方法的特异性、灵敏度和稳定性。在前期研究[15]中，采用胰蛋白酶对纯化的长白山白眉蝮蛇类凝血酶进行酶解，利用纳升液相-高分辨质谱（Nano LC-HRMS）和Proteome Discoverer软件分别进行多肽的检测和鉴定，通过BLAST搜索与Uniprot数据库对比分析，筛选了具有种属特异性的长白山白眉蝮蛇类凝血酶特征肽段TLCAGVMEGGIDTCNR。

本研究基于具有种属特异性的白眉蝮蛇类凝血酶特征肽，建立了UPLC-MS/MS检测白眉蝮蛇蛇毒种属来源及类凝血酶含量的方法。该方法专属性强、灵敏高、准确可靠，可进一步推广应用于长白山白眉毒蛇血凝酶药物原料、中间体及其制剂中活性蛋白的检测，对于优选蛇毒原料、优化生产工艺、提高产品安全性具有重要意义。