智能化抗酸杆菌检测在结核诊断中的应用

赵 业，张凯闻，梁 丽，熊 焰，李 挺

结核病是结核杆菌感染导致的慢性传染病，我国结核病病例数居全球前列，其防治工作是医疗人员的重要任务[1]。结核病的治愈率和疫情的有效控制需具有及时和准确的诊断，检测结核杆菌的手段多种多样，其中抗酸染色又称为Ziehl-Neelsen染色[2]。长期以来抗酸染色的操作和诊断均为人工完成，染色质量难以保证，诊断不仅费时、费力，且阳性率低。近年随着全自动染色机在病理科的应用，抗酸染色切片质量明显提高，在一定程度上提高了病理医师检测阳性杆菌的工作效率，但其费时、费力的瓶颈仍未能得到突破。本实验室自主研发CNN平台的结核杆菌识别人工智能(tuberculosis bacillus finder, TB-Finder)，作为抗酸染色病理检测的初筛手段，在临床试验中具有高度敏感性和较高的特异性，为彻底解决结核杆菌抗酸染色病理诊断的难题提供强有力的工具[3]。本文将Benchmark全自动染色和TB-Finder应用于抗酸染色的病理诊断，创建智能化抗酸杆菌检测模式，对比其与传统抗酸杆菌检测模式(手工染色+人工阅片)的实验效率、染色质量和诊断准确率，探讨智能化抗酸杆菌检测在结核病理诊断中的价值及流程优化。

1 材料与方法

1.1 材料收集2019年7月～2020年7月北京大学第一医院病理科诊断肉芽肿性病变的石蜡包埋标本150例，常规4.5 μm厚切片。每例均带已确定抗酸阳性的对照组织，70 ℃烤片40 min。本实验经北京大学第一医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 仪器与试剂

1.2.1仪器 Benchmark自动染色机，Sukura封片机，标签打印机，Leica切片机，Leica水浴，Leica烤片台，3DHISTECH扫描仪。

1.2.2试剂 碱性复红，无水乙醇，石碳酸，亚甲基蓝，1%盐酸乙醇，苏木精，Depar脱蜡液，LCS液，Wash清洗液，蒸馏水等。

1.3 实验方法

1.3.1手工染色 操作步骤：(1)切片脱蜡至水；(2)入石碳酸复红液1 h，入37 ℃或56 ℃温箱孵育30 min；(3)蒸馏水洗净；(4)0.5%盐酸乙醇分化；(5)蒸馏水洗，用0.1%亚甲基蓝水溶液复染10 min；(6)蒸馏水洗，经95%乙醇分化；(7)100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固[3]。

1.3.2Benchmark全自动染色 (1)检查：开机后检查机器是否运转正常，查看缓冲试剂桶内的试剂及废液桶，确保有能够完成当次染色的液位；(2)备片：在电脑中选择需要的染色项目方案，打印标签，贴于切片，制片并烘干；(3)运行：将玻片平放在染色托上，标签侧朝外，组织朝上，确定四角锁定好后关闭载片仓，将染色项目试剂放入试剂台，打开试剂盖，点击“运行”，机器自动扫描每张玻片和试剂，电脑显示工作状态图为黄色并出现倒计时，染色自动开始；(4)完成：工作状态图为绿色，取下玻片，运行清洗项目(图1)。

图1 自动染色机基本结构

1.4 病理诊断

1.4.1人工诊断 由两位病理医师分别阅片、作出病理诊断；诊断一致的病例，记录为最终诊断；诊断不一致的病例，共同阅片、讨论、达成一致，作为该病例的最终诊断。

1.4.2智能化诊断 采用TB-Finder初筛+病理医师复核的模式。(1)采用3DHISTECH扫描仪扫描抗酸染色切片，数字切片提交TB-Finder。(2)TB-Finder初筛采用两阶段模型设计，第一阶段为目标检测阶段，目的为识全切片图像上的所有杆菌候选物，采用具备State-of-the-art性能的目标检测神经网络RetinaNet基础网络结构，并加入可变卷积、Swish激活函数、半精度训练等优化设计。采用包围框标注记录杆菌在截图上的顶点位置，最终模型在测试集上达到mAP@0.5=0.88。第二阶段为分类阶段，根据第一阶段的检测结果将整张切片分为阴性、阳性。从第一阶段的检测结果中选出置信度最高的10个杆菌候选物，将检测框置信度、检测框大小作为特征值输入SVM模型。根据500例具有活检诊断记录的抗酸杆菌切片，其中200例原始诊断为杆菌阳性、300例诊断为阴性，采用6 ∶2 ∶2的数据拆分比例，模型在测试集上达敏感性100%和特异性76%。(3)病理医师复核：TB-Finder标注的阳性杆菌，病理医师对数字图片进行复核，有疑问的病例在光镜下进行验证。(4)最终病理诊断：TB-Finder初筛为阴性者为抗酸阴性；TB-Finder初筛为阳性者，需经病理医师在数字切片或光镜下确认，仍为阳性者为抗酸阳性(图2)，反之为抗酸阴性[4]。

图2 结核病-人工智能+人工复核阳性病例数字图像，抗酸染色

1.5 染色切片质量评估由两位病理医师分别对手工和自动染色切片进行质量评分。评分标椎：(1)整体颜色：颜色不一致1分，一致性好2分；(2)菌体颜色：浅红色1分，紫红色2分(阴性病例的评分参考阳性对照组织)；(3)背景颜色：不着色1分，蓝色2分；(4)脱片：部分脱片1分，无脱片2分；(5)污染：有杂质1分，无杂质2分。上述各项评分相加为总评分：5分为差，6～8分为良，9～10分为优[5]，取两位医师评分的平均值作为该切片的最终评分。

2 结果

2.1 抗酸检测阳性率150例样本经智能化检测模式的阳性率为29.3%(44/150)，传统检测模式的阳性率为6.6%(10/150)。

2.2 切片质量评分手工染色150例，切片质量评分5～10分，平均7.8分，优98张，良45张，差7张，优良率95.3%(优65.3%、良30%)。自动染色150例，切片质量评分7～10分，平均8.9分，优112张，良38张，差0张，优良率100%(优74.7%、良25.3%)；两者差异有显著性(P<0.05)。

2.3 效率(1)染色：手工染色全流程耗时约110 min(含脱蜡)，自动染色约48 min，自动染色节约时间62 min。手工染色，一次最多染4～8张，自动染色一次通量为20张。(2)诊断：人工阅片每张切片平均耗时30 min，TB-Finder则只需2 min，另行切片扫描和人工复核，智能化系统每张切片平均耗时10 min。(3)染色+诊断全流程：智能化平台每张切片耗时12 min，传统模式每张切片耗时57 min，智能化平台节约时间成本约78%。

2.4 人工阅片和TB-Finder阅片的比较150例机染切片，医师人工阅片阳性21例。TB-Finder阅片阳性54例，不一致病例33例，均为人工阅片阴性，TB-Finder阅片阳性。

3 讨论

长期以来抗酸染色均为手工完成，存在不稳定因素较多，对操作者的技术要求高，导致染色质量难以控制。结核杆菌长度仅约4 μm，直径不足1 μm，是影响结核病理诊断的主要因素[5-6]。因此，提高抗酸染色切片质量，降低寻找阳性杆菌的难度，是提升抗酸染色在结核病理诊断中应用价值的两大要素。

人工智能源于1956年美国召开的人工智能达特茅斯夏季研讨会[7]，CNN是近年发展的一种非常高效的人工智能，尤其在图像识别领域取得惊人的突破，同时具备高效率、客观稳定、长时间高负荷工作等优点。与复杂的组织细胞形态相比，结核杆菌形态简单，识别难度小，将人工智能引入抗酸染色切片的初筛可提高检出率。本课题组根据CNN平台自主研发的结核杆菌识别人工智能TB-Finder，作为抗酸染色病理检测的初筛手段，具有高度敏感性和较高的特异性[4]。

尽管人工智能在寻找抗酸杆菌的工作中具有显著优势，但其适应能力远不如病理医师，因此一致性好、色彩鲜亮、对比度好的染色切片是其发挥强大工作能力的基础。手工染色切片受多种不确定因素的影响，严重影响了人工智能的工作效率。Benchmark全自动染色机是由染色模块、缓冲液模块、废液收集模块于一体的统一机械化运行，从而确保染色环境的相对封闭，减少了人为和外界环境变化的干扰，同时恒量的液体滴加和标准化的机械操作，使每一次染色的浓度均能保持一致，最终保证了切片颜色的均匀性和一致性。本组150例石蜡样本，每个样本连续切片2张，平行进行手工抗酸染色和自动抗酸染色，自动染色组(平均分8.9分、优良率100%)切片染色质量评分高于手工染色组(平均7.8分、优良率95.3%)。因此，与手工染色相比，自动染色更能匹配人工智能的应用，顺应了人工智能时代病理发展的潮流。

本组将Benchmark全自动染色和TB-Finder整合应用于抗酸染色的病理诊断，创建智能化抗酸杆菌检测平台，对比传统抗酸杆菌检测模式(手工染色+人工阅片)，病理诊断阳性率明显提高(智能化模式29.3%vs传统模式6.60%)，且染色过程节约了时间成本，TB-Finder初筛又为病理医师节约了大量阅片时间。本组结果显示，染色加诊断全流程，智能化平台比传统模式节约时间成本约78%。

先进技术的应用极大提升了生产力，但却并非完全替代人的作用。首先，在染色环节，由于机器的工作是连续不间断的，出现错误需从新开始，降低效率。因此，应做好前期的准备工作，尤其是标签准备、废液桶及试剂瓶液位、染色试剂的剩余完成次数等关键环节需操作人员重点关注。为保证机器稳定、高效的运行，经常维护，定期清洗，注意试剂pH值的把控，严格规范操作等细节都是必不可少的。其次，自动化虽然降低了人的劳动强度，提高了工作效率，但制作优质的抗酸染色切片仍需实验人员具备高度的责任心和精益求精的工作作风。最后，病理诊断必须由病理医师完成。本实验人工阅片和TB-Finder判读结果不一致者33例(22%)，将其病例的TB-Finder标注图像由病理医师复核，其中23例为真阳性，不一致的原因是人工阅片漏诊所致；其中10例TB-Finder找到的阳性菌不在肉芽组织和坏死中，被医师判为非致病菌，属于假阳性。由此可见，在实际应用中病理医师应认识到TB-Finder的局限性，尤其是无法鉴别致病菌和非致病菌。因此，TB-Finder的检测结果必须经病理医师复核确认后，才能作出抗酸染色阳性的诊断。

综上所述，由自动染色、人工智能组成的智能化抗酸杆菌检测平台，不仅提高了工作效率，降低劳动强度，减少漏诊率，提高结核的检出率，还有助于规范质量控制和减少环境污染，使抗酸染色在结核诊断中发挥重要作用，值得临床推广。