沙利度胺治疗β-地中海贫血外周血miR-223-3p水平变化及临床价值

朱卫健，何 颖，黄慕芳，付社竹，王小琪，李志新，陈丽君，李小亮

(珠海市人民医院 暨南大学附属珠海医院 血液风湿科, 广东 珠海 519000)

β-地中海贫血(β-thalassemia)是一组先天遗传性溶血性疾病，也是世界上最常见的单基因遗传病之一，在我国南方及部分沿海地区发病率高。对于中间型及重型-地中海贫血临床上缺乏有效的治疗手段，这些患者需要定期输血、祛铁治疗来维持生命，患者总生存时间短，生存质量及预后差。目前治愈方法包括，骨髓移植和基因或细胞治疗，但治疗费用昂贵，难以获得匹配的骨髓，特别是基因治疗，其安全性仍受到挑战。

药物诱导产生胎儿血红蛋白(HbF)来替代或是逆转α/β珠蛋白比例失调，能减轻β-地中海贫血的症状，被认为是治疗重型β-地中海贫血的新策略，Chen等[1]的多中心、安慰剂、随机对照临床试验显示沙利度胺治疗β-地中海贫血疗效显著，总有效率达69.4%，使患者脱离输血或减少输血，但其具体作用机制尚未阐明。

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为19～22个核苷酸的非编码小分子RNA，参与转录后的基因调节，并在多种细胞发育过程中发挥作用，如细胞增殖、分化和凋亡[2-3]。越来越多的miRNAs被发现在β-地中海贫血的发病过程中起着重要作用，这些miRNAs可起到改善或加重β-地中海贫血的作用，miRNAs与靶mRNA的3'UTR区结合，并在转录后水平调节HbF的表达，从而影响β-珠蛋白合成减少或缺失引起的严重贫血。随着miRNAs的更深入研究，科学家们开始探索miRNA在不同类型的血红蛋白病调节中的作用，已有充分证据表明，miRNAs对红细胞生成至关重要，在HbF表达调控中发挥关键作用[4]。有研究发现miR-26b、miR-151-3p、miR-29a-3p、miR-99b-5p通过抑制BCL11A，从而诱导γ-珠蛋白表达，用于治疗地中海贫血及镰状细胞性贫血(SCA)等遗传性血红蛋白病[5-7]。而miR-15a和miR-16-1通过转录因子MYB3与HbF升高相关联，miR-223-3p靶向LMO2的3'UTR下调γ-珠蛋白表达[8]，这些miRNAs可能是诱导HbF表达的靶分子。

我们从文献报道与地中海贫血相关的候选miRNAs筛选出miR-223-3p，检测miR-223-3p在沙利度胺治疗β-地中海贫血患者在服药前后的表达水平变化及分析miR-223-3p与血红蛋白浓度及HbF的相关性，以期为药物诱导γ-珠蛋白转录后机制探讨提供新的依据。

1 资料与方法

1.1病例选择 选取自2018年2月-2020年12月在我院参加临床试验的输血依赖型β-地中海贫血患者8例，其中男性3例，女性5例，健康对照组选用同期在珠海市人民医院的健康体检者8例，无相关疾病，血常规正常。纳入标准：①年龄≥14岁, 经基因检查诊断符合中-重型β-地中海贫血；②ECOG体力评分0～3分，需定期输血及祛铁治疗；③末次输血距入组时间大于14天。排除标准：①合并感染性疾病、恶性肿瘤、肝肾功能不全等；②3个月内有动静脉血栓形成病史者；③合并其他原因引起的贫血未纠正者；④精神病患；⑤不能口服药物患者；⑥妊娠、哺乳期女性和不愿采取避孕措施的育龄受试者；⑦ 对本品过敏者、受试期间需要从事驾驶员及机器操作职业者。研究经珠海市人民医院伦理委员会讨论通过，所有患者或其监护人均签署知情同意书。沙利度胺组口服沙利度胺100 mg/次，1次/d，于晚餐后顿服，可耐受者3天后加量到150 mg/d。

1.2试剂与仪器 淋巴细胞分离液、Trizol购自天津灏洋生物制品科技有限公司，逆转录PCR试剂盒、miRNAs引物、加尾法miRNA qtPCR试剂盒(广州锐博生物公司)，酶标仪(Thermo Scientific, 美国)，Real-Time PCR 仪(Bio-Rad, 美国)、普通 PCR 扩增仪(Applied Biosystems, 美国)。

1.3外周血单个核细胞及总RNA的提取 早晨空腹，分别抽取输血依赖型β-地中海贫血患者治疗前和治疗后及正常对照组静脉血5 ml，EDTA抗凝，1 500 r/min离心10 min，去除血浆后的细胞，用淋巴细胞分离液密度梯度离心，分离外周血单个核细胞(PBMCs)所在的白膜层细胞，PBS洗涤2次，-80 ℃冻存备用。应用Trizol提取β-地中海贫血患者治疗前和治疗后及正常对照组PBMCs细胞中总的RNA。

1.4qRT-PCR检测各组miR-223-3p表达水平 将各组总RNA采用逆转录法合成相应cDNA，采用 CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)程序检测, miR-223-3p引物为：5’-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3’，计算基因表达水平时, 采用2-ΔΔCT法计算miR-223-3p的相对于标准品的基因表达水平。

2 结 果

2.1两组临床资料比较 8例β-地中海贫血中，有4例已行脾切除。β-地中海贫血患者的红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hb)、红细胞比容 (Hct)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)，均显著降低(P<0.05)，血小板计数(PLT)及白细胞计数(WBC)均升高(P<0.05)，见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2β-地中海贫血患者外周血单个核细胞miR-223-3p表达水平 本研究发现β-地中海贫血患者外周血单个核细胞中miR-223-3p相对表达量为0.191±0.089，显著高于对照组0.053±0.039(P=0.003)，口服沙利度胺后miR-223-3p相对表达量为0.106±0.047(P=0.047)，表达量下降，与β-地中海贫血患者服药前相比差异有统计学意义。见图1。

图1 miR-223-3p在各组中的相对表达水平 注：*P<0.05

2.3miR-223-3p表达水平与临床指标的相关性 β-地中海贫血患者外周血单个核细胞miR-223-3p表达水平与Hb水平(r=-0.488，P=0.015)，HCT(r=-0.420，P=0.004) 呈显著负相关，见表2、图2。

表2 miR223-3p相对表达水平与临床指标的相关性

图2 miR-223-3p相对表达水平与临床指标的相关性

3 讨 论

β-地中海贫血一种常染色体隐性遗传的血红蛋白疾病，是由于β珠蛋白基因突变或缺失引起的相应β肽链合成不足或缺如，相对过剩的α链沉积于红系细胞内形成包涵体，导致无效红细胞生成、慢性溶血、微血管阻塞等病理改变，β-地中海贫血中α/β链不平衡是其发病的病理生理基础[9]，增加HbF是克服贫血和无效造血的重要治疗手段。正常的人类个体在发育过程中，存在珠蛋白基因表达的转换，出生后γ珠蛋白基因逐渐关闭，主要表达β基因。诱导γ-珠蛋白链表达可以平衡病理性α珠蛋白链增多，从而改善贫血和终止输血依赖[10]。

在许多研究和综述文献中，对药物在γ珠蛋白基因激活中的可能机制进行了阐述。科学研究已经确定的HbF分子调控因子，包括BCL11A、MYB、HBSIL、KLF1和miRNAs[11]。在这些调控通路中，miRNAs对HbF诱导的调控转录后通路起着重要作用。

Chen等[1]的多中心、随机、双盲的2期临床试验中显示，接受沙利度胺治疗的β-地中海贫血患者的 Hb 中位浓度升高达到了14.0(2.5～37.5) g/L ，而接受安慰剂治疗的患者的Hb浓度没有显著变化。在12周内，接受沙利度胺和安慰剂治疗的患者的平均红细胞输注量分别为(5.4±5.0) U 和(10.3±6.4) U(P<0.01)，在扩展阶段，沙利度胺治疗24周后Hb浓度持续增加，达到(104.9±19.0) g/L，无需输血。表明沙利度胺为有效的HbF诱导剂，同时以往的研究揭示，沙利度胺诱导胎儿Hb的可能机制包括：①有效增强源于β珠蛋白基因突变的造血干细胞(HSCs)红系祖细胞中GATA-1和EKLF的表达，诱导γ珠蛋白基因表达HbF[12]；②由于炎性细胞因子如由核因子κB(NF-κB)诱导抑制肿瘤坏死因子(TNF-α)，血管内皮生长因子(VEGF)和前列腺素E2(PGE2)合成与释放的活性氧(ROS)的增加有关，ROS可以启动P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，导致HbF水平升高[13]；③通过诱导信号转导和转录激活子5(signal transducer and activator of transcription 5, STAT5)和促进红细胞生成细胞凋亡的外部通路的抑制导致增加GATA-1转录因子的表达，而GATA-1能有效地诱导γ珠蛋白基因表达HbF[14]。

miRNAs通过转录后调控对HbF诱导方面的研究较少，本研究检测服用沙利度胺后miR-223-3p表达水平的变化，推测其诱导HbF的可能机制。

生物信息学预测显示，β-地中海贫血患者的外周血miRNA改变了2 833个基因。来自β-地中海贫血患者差异调控miRNA已经被预测其广泛调控的功能，β-地中海贫血患者的血浆外泌体具有许多差异表达的miRNA谱，这些miRNA谱可能参与各种生物过程。Sun等[8]研究将LMO2的3' uts及其种子序列突变版本克隆到萤火虫荧光素酶报告基因的开放阅读框(ORF)下游，并评估miR-223下调荧光素酶表达的能力。发现miR-223-3p与LMO2野生型3'UTR结合，降低萤火虫荧光素酶活性，此外，在K562细胞中，MiR-223-3p模拟物显著下调了LMO2和γ-珠蛋白的表达，因此，判断miR-223-3p通过LMO2靶向下调γ-珠蛋白表达。

我们应用实时定量PCR的方法，检测文献中报道过红系调控有意义的miRNAs，筛选miR-223-3p这个候选miRNAs，并对输血依赖型β-地中海贫血及口服沙利度胺有效的患者进行检测，实验结果显示：miR-223-3p在输血依赖型β-地中海贫血患者中高表达，口服沙利度胺后miR-223-3p 表达水平下降。

这些结果表明，miRNA是β-地中海贫血诊断和预后的潜在生物标志物，基于miRNA的治疗策略可能被用作有效治疗β-地中海贫血的方法。对红细胞生成中miRNAs的研究阐明了其潜在的调控机制，并促进了相关诊断和治疗的发展。然而，需要进一步的研究来验证这一假设，特别是通过细胞、动物实验来明确具体的调控通路。总的来说, 沙利度胺通过下调miR-223-3p 表达水平，可能使调控γ珠蛋白基因的重新激活，从而改善β-地中海贫血的病理生理和临床症状，miR-223-3p有可能成为β-地中海贫血新的治疗靶点。