灯笼红香瓜枯萎病病原菌分离鉴定及药剂防治研究

白锦江，赵 健 ，刘 颖，郑红丽 ，赵明敏

（1.内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010011；2.鄂尔多斯生态环境职业学院，内蒙古 东胜 012000）

甜瓜（Cucumis melo L.）又称香瓜，属葫芦科一年生蔓性草本植物，是我国主要的瓜类经济作物[1]。灯笼红香瓜是内蒙古巴彦淖尔市五原县最具特色的果蔬产品之一，因其成熟果实外形酷似灯笼，被誉为灯笼红。目前，五原县灯笼红香瓜被正式纳入全国名特优新农产品名录和全国农产品地理标志[2]。在温室大棚内种植灯笼红香瓜，实现了多季节供应，经济效益较高[3]。然而，温室连作情况日益严重，导致灯笼红香瓜病虫害逐年加剧，产品产量及品质降低。

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）属半知菌亚门（Deuteromycotina）镰刀菌属（Fusarium），是一种土传病害，能引起枯萎病[4]。1894年Smith在美国的南卡罗来纳州发现甜瓜枯萎病后，该病害已蔓延至世界各甜瓜产区。尖孢镰刀菌在土壤中作为厚垣孢子可以存活数十年[5]。尖孢镰刀菌包括致病性和非致病性菌株，并根据寄主范围分为不同的营养型，有些进一步细分为不同的生理小种[6]。该菌能侵染葫芦科、芭蕉科、蔷薇科、十字花科、茄科和豆科等100多种植物[7]。植株被尖孢镰刀菌侵染后，发病症状多种，初期的症状表现为嫩叶上出现褪绿现象，之后老叶开始下垂。苗期植株发病后迅速死亡；成株期发生叶脉失绿和叶片下垂，植株长势暂缓，下部叶片黄化，形成不定根，叶片和嫩茎萎蔫，剩余叶片边缘坏死，全株死亡[8]。维管束组织的褐变是尖孢镰刀菌引起枯萎病的最鲜明特征。从盛花期到果实成熟期，在较老的植株上，症状会变得明显[9]。尖孢镰刀菌在植株根部维管束中定殖，导致导管堵塞，地上部分枯萎，根表皮产生褐色坏死斑，后期根部腐烂甚至整株植株死亡，严重影响植物的生长发育、产量及品质[10]。

随着瓜类枯萎病的严重发生，目前已对其病原菌进行分离和鉴定。RAHMAN等[11]利用EF引物对马来西亚丰盛港、沙登和关丹3个主要瓜类产区的瓜类枯萎病主要病原物进行分离鉴定，确定其病原为尖孢镰刀菌。耿丽华等[12]利用形态学特征和rDNA ITS序列分析法，鉴定了北京通州试验基地的甜瓜新病害是由尖孢镰刀菌引起。该病原菌在温湿度条件合适的情况下会迅速产孢并侵染作物，如不能及时进行预防与防治，会造成农产品产量及质量严重下降。

对环境友好的植物源药剂与绿色发展更贴切。李家洲等[13]利用中药材植物的水提液与乙醇提液对尖孢镰刀菌进行菌丝生长和孢子萌发的研究，结果表明，白丁香、黄连、姜黄的水提液对病原菌有良好的抑制效果。吕云霞[14]提出利用中药防治对作物的难治病害进行防控，田间试验结果表明，碧护、禾生素等含有植物类物质的药剂混合使用，对马铃薯、番茄、瓜类、大豆的难治病害有一定的防治效果，该防治方法还可以起到缓解药害、肥害，促进生长等作用。ZHENG等[15]对马铃薯枯萎病防治的研究结果表明，植物源提取物蛇床子素对马铃薯枯萎病病原菌具有一定的抑制作用。

为了明确内蒙古巴彦淖尔市五原县灯笼红香瓜枯萎病的病原菌，本研究对五原县甜瓜枯萎病进行样品采集、病原菌分离、回接试验及病原菌分子鉴定，同时研究了不同药剂对该病害的室内防治作用，旨在为内蒙古五原县灯笼红香瓜枯萎病的防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试病样：2020年4月25日在巴彦淖尔市五原县隆兴昌镇温室内采集新鲜样本，随机选取9株症状典型的灯笼红香瓜病株。培养基及试剂：马铃薯葡萄糖培养基（potato dextrose agar，PDA）为马铃薯200 g﹑葡萄糖 20 g﹑琼脂粉 20 g﹑蒸馏水 1 000 mL。马铃薯葡萄糖液体培养基（potato dextrose，PD）：不加琼脂粉，其他成分同PDA。灯笼红香瓜种子采购自巴彦淖尔市临河区种子市场。内蒙古农业大学植物病毒课题组自主研发的3种中药复合制剂分别命名为植物免疫诱抗剂JM1、JM2、JM3，植物源药剂蛇床子素由西安全奥生物科技有限公司提供。

1.2 病原菌分离培养

在随机选取发病的香瓜茎基部病健交界部位切取大小约为0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的组织块，75%乙醇消毒30～40 s，然后移入5%次氯酸钠消毒3 min，用无菌水冲洗3次，再用高温灭菌的滤纸吸干组织块表面的水分。消毒后的组织块移入PDA平板，28℃恒温培养5 d，挑取菌落边缘新生菌丝进行纯化培养，5 d后挑取新生菌丝，采用梯度稀释法进行单孢纯化。将纯化好的真菌分离物接种到PDA斜面试管内，28℃培养3 d后，置于4℃冰箱中保存备用。

1.3 病原菌形态观察

将分离得到的真菌分离物接种在PDA平板上，在（28±1）℃培养箱中恒温培养，观察分离物在PDA培养基上的特征，包括菌落的形状、大小、颜色，分别记录菌落的形态和颜色。在培养好的菌落表面用无菌接种针挑取少量菌丝，置于载玻片上，滴加无菌水，轻压盖玻片制成临时玻片，然后在显微镜下观察病原菌的菌丝、孢子形态及菌核的有无，并用显微镜附带软件对菌丝和分生孢子进行拍照，根据分离物在PDA培养基平板上的培养性状及显微观察的结果，对分离物进行初步鉴定。

1.4 病原菌回接试验

灯笼红香瓜育苗前将种子在水中浸泡1 h，再用2%的次氯酸钠消毒10 min，之后用无菌水冲洗，最后在湿润纱布上进行种子催芽，待种子发芽后将种子播种到已灭菌的基质土中。待植株3～4片叶时，用分离得到的菌株进行致病性测定，采用无伤接种法对植株进行孢子悬浮液灌根接种。试验设置3次重复，每次重复接种10棵植株，以不带菌的PD液体培养基作为对照组。分别挑取病原物真菌菌丝放置于PD液体培养基中进行摇菌产孢，采用血球计数法计算孢子量。在每棵植株距茎基部1 cm处灌根1×107个孢子，将试验组和对照组置于25℃温室中保湿培养，连续观察。待发病后，重新分离病原物，进行柯赫氏法则验证。

1.5 分子生物学鉴定

利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取分离物的基因组 DNA。用真菌通用（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/ITS4：TCCTCCGCTTAT TGATATGC）扩增病原菌的内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS），25 μL PCR 体系为：ddH2O 17.375 μL，正反向引物 （10 μmol/L） 各 1 μL，DNA 模板 1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，r-Taq酶 0.125 μL，反应条件为94℃预变性3 min；94℃变性 30 s；55℃退火 30 s；72℃延伸 1 min，34个循环；最后72℃延伸10 min。取PCR产物5 μL用1%琼脂糖进行凝胶电泳，在凝胶成像仪上检测并拍照，将PCR扩增成功的产物送至华大基因公司测序。测序结果在NCBI上利用BLASTn进行同源序列检索，选取相似序列，应用MEGA 7.0软件，采用ClustalW算法对序列进行比对，用比邻法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树。

1.6 药剂室内防治试验

采用盆栽法选取自制的植物免疫诱抗剂JM1、JM2、JM3原液和蛇床子素（5 mg/mL）进行防治试验。待灯笼红香瓜幼苗3～4片叶时，分别使用5 mL药液在距离植株根系1 cm处灌根。每种药剂处理接种10株香瓜幼苗。24 h后采用无伤接种法灌根接种已分离的病原菌。以健康植株为阳性对照，未做药剂处理但接种病原菌的处理为阴性对照。观察发病情况，统计发病植株的病情指数和药剂的防治效果。参考周婧等[16]的甜瓜苗期枯萎病分级标准，0级：茎基部无褐变；1级：茎基部褐变；2级：茎基部1/2处褐变；3级：茎基部2/3处以上褐变；4级：茎基部到顶端所有维管束褐变，根部坏死。

1.7 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010软件进行数据整理，并用SPSS 25.0统计学软件中的Duncan新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 病害症状

田间采集的灯笼红香瓜枯萎病的症状表现为老叶萎蔫（图1a），褪绿叶片边缘坏死（图1b）。叶片从基部向顶端逐渐萎蔫，叶脉失绿，植株生长缓慢、下部叶片黄化、叶片和嫩茎萎蔫、落叶，症状严重的植株叶片全部萎蔫，全株死亡。后期植株根部出现褐变，拔出病变植株观察根部，茎基部有缢缩（图1c），根部维管束组织变褐、黑化坏死（图1d）。

图1 灯笼红香瓜枯萎病症状

2.2 灯笼红香瓜枯萎病病原菌分离

通过组织分离法分离获得菌株（TG2）后，将分离菌株在PDA平板上培养6 d。观察菌落呈圆形。菌落生长速率为10 mm/d，气生菌丝呈白色，菌株菌丝体为淡紫色棉絮状﹑浓密，菌落底色呈微紫色（图2）。小型分生孢子长椭圆形或纺锤形，无色透明，大小（2.0～19.5）μm×（2.0～3.9）μm。该菌株与镰刀菌属（Fusarium）真菌的形态特征相同。

图2 病原菌菌落、菌丝和孢子形态

2.3 病原菌回接鉴定

将上述分离的病原菌分离物采取人工接种的方法回接到健康的灯笼红香瓜幼苗植株上（图3a）。接种后第17天，接种病原菌的植株叶片萎蔫，根茎基部变黑和坏死。这些症状与田间采样的植株表现一致（图3b、图3c、图3d）。从回接的甜瓜植株上再次分离出与接种菌株相同的病原菌（图3e、图3f），完成了柯赫氏法则验证该病原菌即为灯笼红香瓜枯萎病的致病菌。

图3 病原菌回接灯笼红香瓜幼苗的症状表现和再次分离菌株形态

2.4 病原菌的分子鉴定

采用通用引物ITS1/ITS4对灯笼红香瓜枯萎病病原菌（TG2）进行PCR扩增，获得了长度为576 bp片段。纯化后进行测序分析。将上述序列在NCBI数据库中进行同源序列BLAST比对。选择近缘序列，采用MEGA 7.0构建系统发育进化树（图4）。结果表明，TG2与Fusarium oxysporum聚在一枝上。结合形态学特征和ITS序列分析确定TG2为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。

图4 基于ITS序列的分离菌TG2构建系统发育进化树

2.5 不同药剂对灯笼红香瓜枯萎病防治效果

由图5可知，阳性对照的健康植株地上部叶片正常，地下部根系呈白色；阴性对照的处理根系黑化坏死，叶片萎蔫程度严重；药剂处理后的植株地上部叶片有褪绿，少量叶片坏死，地下部褐变程度较轻。由表1可知，蛇床子素与植物免疫诱抗剂JM2的防治效果较好，防治效果分别为65.28%、61.43%；植物免疫诱抗剂JM1的防治效果为45.99%。此外，蛇床子素的病情指数最低，为25.00，说明不同药剂在一定程度上降低了植物受病原菌侵染破坏的程度。

表1 4种药剂对灯笼红香瓜枯萎病的防治效果

图5 4种药剂对灯笼红香瓜枯萎病的防治效果

3 讨论与结论

瓜类枯萎病是香瓜上最重要的侵染性病害。本研究从内蒙古巴彦淖尔市五原县采集灯笼红香瓜发病样品，分离得到病原菌TG2。通过病原菌形态观察及其ITS序列分析，鉴定灯笼红香瓜病害的病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。在美国，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是引起加利福尼亚州中央山谷周围甜瓜枯萎病的主要病原菌[17]。延涵等[18]报道了引起东北地区甜瓜枯萎病的病原菌是尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。黄文枫等[19]报道尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起了海南薄皮甜瓜枯萎病。香瓜枯萎病病原菌一旦发生大面积侵染很难根治，病原菌有性阶段产生的厚垣孢子可长时间存活，宜早发现早防控。本研究首次在内蒙古巴彦淖尔市五原县发现并鉴定甜瓜枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。苗丹等[20]研究发现，植物源药剂对马铃薯枯萎病的防治效果较好，抑菌效果达69.3%。MASI等[21]对于药用植物积雪草提取物的研究发现，除了三萜类成分约占提取物重量的45%，还发现了前所未有的 2α、3β、6β、23-四羟基油酸-13（18）-的新型三糖苷皂和异端胺酸。ZHANG等[22]从披针叶野决明（Thermopsis lanceolata R.Br.）的种子中分离出7种生物碱类化合物，其中一种可以显著抗番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV），另外一种对蚕豆蚜有很好的杀虫效果。以上研究结果说明对病虫害起抑制作用的药用物质不止一种，或者一种植物的多种分离物质同时作用才会有药用价值。本研究中使用的植物免疫诱抗剂是由多种药用植物熬制而成，说明起到防治枯萎病作用的不止一种物质，或者是多种抑制物质同时作用形成防治效果。但防治机制尚不清楚，还需要进一步研究。本研究表明，供试的植物免疫诱抗剂JM1、JM2、JM3和植物源药剂蛇床子素具有一定的防治效果，均在一定程度上抑制了香瓜枯萎病病原菌侵染，该研究结果可为灯笼红香瓜枯萎病的绿色防控提供参考。