基于UHPLC-QE-MS的CCI模型大鼠的血清代谢组学研究

白凤媛, 赵冬梅, 蔡仁军, 宋素菲, 刘 涛*, 徐秋玲*

1. 海南医学院第一附属医院, 海南 海口 571199

2. 海南医学院中医学院， 海南 海口 571199

引 言

慢性疼痛是最常见的慢性疾病之一， 不仅给患者带来躯体和精神上的痛苦、 降低生活质量, 同时增加医疗支出,加重家庭和社会的经济负担。 慢性疼痛的致残率高， 医疗费用支出巨大[1-2]。 目前临床治疗疼痛的药物包括抗抑郁药、 NMDA 拮抗剂、 阿片类镇痛药等， 然而这些药物大部分具有较多的不良反应， 限制了其广泛应用。

慢性疼痛的代谢组学研究尚处于起步阶段。 代谢组学研究在其他医学领域取得了成功。 这些成就激励研究人员扩大代谢组学研究， 可以提高对慢性疼痛基本机制的理解， 并提供诊断、 预测和监测慢性疼痛状况的工具。

1 实验部分

1.1 实验动物及分组

12只无特定病原体(SPF)级雄性大鼠购自长沙市天勤生物技术有限公司， 许可证号： SCXK(湘)2019-0013。 体重180～200 g。 随机均分为正常组、 慢性压迫损伤(chronic constriction injury, CCI)组， 每组6只。 CCI组进行左侧坐骨神经结扎手术造成慢性压迫损伤(CCI)模型， 正常组除不结扎坐骨神经， 其余步骤实验组。 术后14天， 腹主动脉采血， 进行代谢组学检测。

1.2 方法

参考Bennett等推荐的方法制备 CCI模型[3]。 将大鼠用1%的戊巴比妥钠(4 mL·kg-1)麻醉后， 在左侧坐骨神经分叉前的主干部位距神经起始处上方2 mm用4-0羊肠线结扎坐骨神经4道， 每道间隔约1 mm， 结扎的松紧度以打结时可见肌肉轻微抽动为准。

2 结果与讨论

2.1 大鼠血清差异代谢物的层次聚类分析热力图

对差异代谢物的定量值计算欧式距离矩阵(Euclidean distance matrix)， 以完全连锁方法对差异代谢物进行聚类， 并以热力图展示。 结果见图1和图2。

图中横坐标代表不同实验分组， Bm为CCI组， K为正常组， 纵坐标代表该组对比的差异代谢物， 不同位置的色块代表对应位置代谢物的相对表达量， 红色表示该物质含量高表达， 蓝色表示该物质含量低表达。

图1 POS(正离子模式)

图1表明, 正离子模式下， 喹啉、 肉毒碱、 3-甲基胞嘧啶、 L-α-氨基丁酸、 脯氨酸羟脯氨酸、 硫胺素、 羟基苯乙酰甘氨酸、 胆固醇、 乙苯等代谢物的表达升高； 4-胍丁酸甲基吡嗪、 3-甲基组氨酸、 D-丙氨酸、 丙酰肉碱、 肌苷、 胸苷、 L-天冬氨酸、 N-乙酰组氨酸等代谢物的表达降低。

图2表明， 负离子模式下， 2-甲基戊二酸(R)-3-羟基丁酸、 吲哚乙酸、 焦谷氨酸、 十一烷酸、 二十碳五烯酸等代谢物的表达升高； 牛磺酸、 神经酸、 3-甲基组氨酸、 马兜铃酸、 马尿酸、 吲哚丙烯酸、 苏糖酸等代谢物的表达降低。

图2 NEG(负离子模式)

2.2 差异代谢物的富集分析

利用超高效液相色谱Q萃取质谱分析(ultra-high performance liquid chromatography q exactive mass spectrometry, UHPLC-QE-MS)并结合PCA(主成分分析)、 OPLS-DA(正交最小二乘法判别分析)和OPLS-DA置换检验等多元统计分析方法后， 对上述层次聚类分析热力图筛选出的差异代谢物, 利用MetabolicAnalyst5.0进行差异代谢物的富集分析。 富集分析气泡图见图3， 富集分析表见表1。

图3 富集分析气泡图

表1 富集分析表

代谢组学是指生物体或细胞在特定生理时期所有小分子量代谢产物的集合[4]。 通过检测血液、 尿液等各种生物样品中的分子来揭示整个代谢概况[5]。 代谢组学的目的是研究生物系统中代谢物的变化, 通过筛选实验组和对照组之间的不同代谢物， 可以研究与不同代谢物相关的生物过程， 以揭示相关生命活动的机制[6]。 代谢组学技术为疾病的发生和治疗机制研究提供了新思路[7]， 代谢组学技术的应用促进了疼痛研究的发展[8]。

目前慢性疼痛尚缺乏特异性的分子生物学指标， 而代谢组学在研究生物标志物方面具有广阔的前景。 王国辽等[8]采用气相色谱-质谱(GC-MS)研究代谢组学， 筛选出大鼠术后急性疼痛和慢性坐骨神经痛的35种差异代谢物。 段昆等[9]通过建立大鼠原发性痛经模型， 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术共筛选鉴定出12种与原发性痛经相关的差异性代谢物。 何瑶等[10]构建大鼠痛经模型， 采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS) 技术筛选出牛磺熊去氧胆酸和溶血磷脂酸等痛经大鼠血浆中的差异性代谢物。 龚思思等[11]运用基于UPLC-QToFMS的非靶向代谢组学方法研究骨关节炎血清代谢物， 结果表明， 血清代谢组学方法能够有效区分病例组和对照组。 本研究以正常大鼠及慢性坐骨神经痛大鼠血清为样本， 采用UHPLC-QE-MS代谢组学技术对其进行差异性代谢物筛选， 结果共筛选出9种差异性代谢物， 主要包括： 有机酸、 有机杂环化合物、 脂肪酰基、 碳水化合物、 核酸、 有机氮化合物、 碳氢化合物、 有机氧化合物、 苯类。 实验结果显示这些差异性代谢物在慢性疼痛的诊断、 机制研究及药物靶点研究中具有重要应用价值。

有机酸、 有机化合物、 核酸等代谢物与慢性疼痛关系密切。 杨菁等[12]研究结果表明， 食用土当归总有机酸具有较好的抗炎镇痛作用， 并且有机酸是食用土当归抗炎镇痛的主要有效成分。 有研究表明[13]当疼痛发生时大鼠脑组织中一氧化氮(NO)、 COX2等化合物表达量明显增加。 研究发现， 有机化合物——甲烷具有镇痛作用[14]。 核酸在慢性疼痛的发生、 发展中均具有重要作用[15]。 本研究结果显示， 与正常组相比， 建立CCI模型后血清中的有机酸、 有机化合物、 核酸等代谢发生了变化， 说明有机酸、 有机化合物、 核酸等可能是引起慢性疼痛的重要靶点。

3 结 论

使用UHPLC-QE-MS代谢组学技术对坐骨神经慢性压迫损伤模型大鼠的血清代谢物进行初步研究， 筛选出的有机酸、 有机杂环化合物、 脂肪酰基、 碳水化合物、 苯类等9类代谢物质可能与慢性疼痛关系密切。 但有机杂环化合物、 脂肪酰基、 碳水化合物、 苯类等包含的相关化学物质详细种类较多， 尚不明确究竟何种物质在慢性疼痛的发生、 传递和调制的过程中起决定作用， 这些差异代谢物在慢性疼痛中的作用机制及其具体靶点还有待进一步深入研究。