油茶皂素在香蕉保鲜中的应用

董 晨，易有金 ，刘思思，李昌珠，肖志红，刘汝宽,

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 410128；2.湖南省林业科学院 省部共建木本油料资源利用国家重点实验室，湖南长沙 410004）

香蕉（Musa nanaLour.）是芭蕉科 （Musaceae）芭蕉属 （Musa） 植物，为热带、亚热带的重要水果之一[1]，是一种典型的呼吸跃变型水果，也是世界上最受欢迎和营养丰富的水果之一。香蕉不仅富含多种维生素，还富含多酚、类黄酮和单宁酸等对人体有益的化合物[2]，因此食用香蕉对人体具有多种益处，例如伤口愈合[3]，抗溃疡[4]，抗菌和抗氧化[5]，抗过敏[6]。但香蕉采后容易受到自身呼吸作用的影响，加快新陈代谢导致腐烂变质，从而造成水果资源浪费以及经济损失。因此，如何控制和延缓采后香蕉果实的腐烂变质已成为香蕉研究领域的主要热点，同时也是本文的研究重点。香蕉镰刀菌（Fusarium incarnatum）为香蕉采后最主要的病原菌之一[7]，可引发香蕉枯萎病，给香蕉产业造成巨大损失。化学保鲜剂在香蕉保鲜方面应用广泛，常用到的化学保鲜剂有二氧化氯（ClO2）[8]、植物生长调节剂如赤霉素类、生长素类[9]。但化学保鲜剂易残留于果实中，危害人体健康，其安全性有待进一步研究。因此，探寻绿色安全的方法进行香蕉保鲜成为焦点之一。油茶皂素（Camellia saponin）又名油茶皂甙，是油茶植物中一类结构相近的五环三萜类皂苷的混合物[10]，是从油茶中提取的主要活性成分之一，具有良好的抗氧化和抗菌活性[11]，应用前景广泛。关于油茶皂素抑菌活性的研究报道较多，早期主要是对食品微生物的控制上，食物极易发生微生物繁殖进而腐败，在处理和存储过程中，食源性致病细菌引起的疾病威胁着公共安全[12]。以油茶皂素作为保鲜剂的文章发表相对较少，钟芳洁等[13]将壳聚糖、茶树油纳米乳液、茶皂素复配溶液处理树仔菜，复合保鲜剂最佳配方为茶皂素2 mg/mL、茶树油纳米乳液4 mg/mL、壳聚糖15 mg/mL，用该配方处理树仔菜，储存6 d，其叶绿素和VC损失较少，失重率低，能较好的保持其感官品质。

本试验通过从自然发病的香蕉果实上分离纯化病原菌菌种，通过形态学鉴定和分子生物学鉴定确定菌种，用菌落生长直径来反映油茶皂素抑菌活性，并以油茶皂素为保鲜剂，采用浸泡的方式，通过测定香蕉果实的失重率、硬度、可溶性固形物、可滴定酸以及呼吸强度的变化来探究不同浓度油茶皂素对香蕉贮藏品质的影响。为油茶皂素应用于采后香蕉保鲜奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香蕉 购于广西农家果园，品种为天宝香蕉，成熟度为七成，挑选果形端正、大小均一、色泽一致、无病虫害以及机械损伤的果实作为实验材料；油茶皂素 纯度70%，购于江西新中野茶业有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（土豆200 g、琼脂15～20 g、葡萄糖（分析纯）20 g、水1000 mL）、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、0.1 mol/L 氢氧化钠溶液、1%酚酞指示剂、20% NaOH、0.4 mol/L NaOH、0.1 mol/L草酸、饱和氯化钡皆为分析纯 购于国药集团化学试剂有限公司。

KK23E18TI 型SIEMENS 冰箱 安徽博西华制冷有限公司；GZ-280-S 型生化培养箱 广智科技设备（韶关）有限公司；ME204-02 型电子分析天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DK-S28 型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；HSP-460BE 型恒温恒湿贮藏箱 湖南力辰仪器科技有限公司；GY-3 型果实硬度计 上海高致精密仪器有限公司；LH-T32 型手持式糖度计 杭州陆恒水质检测有限公司；BX43 型荧光显微镜 南京伊若达仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 镰刀菌的分离纯化 参考黄晓杰等[14]方法，采集具有典型症状的香蕉果实，直接将病原菌菌丝挑取接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，28 ℃恒温培养，相对湿度75%，3 d 后，挑取菌丝反复纯化，直至分离出单一菌落，观察菌落形态特征。

1.2.2 菌株鉴定 采用ITS 序列分析，提取DNA 进行PCR 扩增，PCR 产物回收后使用测序仪ABI3730-XL进行DNA 测序，用NCBI Blast 程序将拼接后的序列文件与NCBI 核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，即为鉴定结果。

1.2.2.1 真菌基因组DNA 的提取 参考唐丽辉等[15]的方法，从平板上刮取一定样品置于2 mL 离心管，加入200 μL Buffer GA（缓冲液GA），振荡至菌体彻底悬浮。向管中加入20 μL 蛋白酶K（Proteinase K）溶液，混匀。加入220 μL Buffer GB（缓冲液 GB），振荡15 s，70 ℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加220 μL 无水乙醇，充分振荡混匀15 s，此时可能会出现絮状沉淀，离心15 s 以去除管盖内壁的水珠。

将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱硅胶离心柱（CB3）中，12000 r/min 离心30 s，向吸附柱CB3 中加入500 μL Buffer GD（缓冲液GD），12000 r/min 离心30 s，再向吸附柱CB3 中加入600 μL Buffer PW（漂洗液PW），12000 r/min 离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3 放回收集管中，12000 r/min离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3 至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。

真菌基因组PCR 扩增（表1）：

表1 引物设计Table 1 Primer design

PCR 扩增反应体系：在0.2 mL 离心管中加入以下成分：

基因组DNA（20 ng/μL）1.0 μL、10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0 μL、Taq 聚合酶（5 μmol/μL）1.0 μL、dNTP（10 mmol/L） 1.0 μL、ITS1引物（10 μmol/L）1.5 μL、ITS4 引物（10 μmol/L）1.5 μL、ddH2O 39.0 μL。将以上混合物轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底，在PCR 扩增仪上进行PCR 反应，反应参数如下：预变性95 ℃，5 min；变性95 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，1 min；终延伸72 ℃，7 min，循环数35。待反应完成后，取3 μL PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR扩增片段。

1.2.2.2 PCR 产物的回收及序列测定与分析 PCR产物用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行。取菌种纯化后的PCR 产物送往派森诺基因有限公司，使用测序仪 ABI3730-XL进行DNA 测序。NCBI Blast 程序将拼接后的序列文件与NCBI 核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，即为鉴定结果。

1.2.3 不同浓度油茶皂素对香蕉镰刀菌抑菌率的测定 参考胡光耀等[16]的方法将纯度为70%油茶皂素配制成不同浓度的油茶皂素溶液（5、10、15、20、25 mg/mL），然后分别吸取0.50 mL 油茶皂素溶液与经灭菌的冷却至50 ℃左右的24.50 mL PDA 充分混合，配制成混合培养基，对照用清水，3 次重复。用10 mm 打孔器取菌饼，取完后放在培养基中心，于温度28 ℃，湿度80%的恒温培养箱里培养，然后每隔一段时间（24 h）观察生长情况。当对照组菌丝基本长满培养皿时，用十字交叉法测量并记录菌落直径，计算抑菌率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌饼直径）×100。

1.2.4 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定 将油茶皂素溶液分别配制成20.00、10.00、5.00、2.50 mg/mL 的PDA 培养基（平板梯度稀释法），倒平板。取10 mm 打孔菌饼放至培养基中央，清水作为对照，置于28 ℃恒温培养箱里培养3 d，重复3 次，以无病原菌长出的最低油茶皂素溶液质量浓度为MIC。继续培养1 周，以无病原菌生长的最低油茶皂素溶液质量浓度为MBC。

1.2.5 香蕉前处理方法 先将香蕉表面擦拭干净再用不同浓度油茶皂素处理香蕉，研究其对香蕉采后贮藏品质的影响。试验共设4 个处理组，3 个对照组，每组30 根香蕉，生物学重复三次。根据前期预实验结果将其中4 个处理组分别用15、20、25、30 mg/mL浓度的油茶皂素溶液浸泡1 min，以1%壳聚糖浸泡作为阳性对照，清水作为阴性对照，不做任何处理作为空白对照，浸泡后取出，在通风处自然晾干后分装于聚乙烯保鲜袋中，封口扎洞，置于温度为16 ℃，相对湿度为85%的恒温恒湿贮藏箱中贮藏25 d。

1.2.6 香蕉采后主要品质指标测定

1.2.6.1 失重率的测定 方法参考曹建康等[17]，每组取3 个果实，做上标记后固定作为测定重量的样品，分别放在电子天平上称重，记录每个果实的重量（g）。计算每组果实平均重量，失重率公式如下：

式中m0为香蕉处理前的初始质量，g；m1为香蕉浸泡并放置数日后的质量，g。

1.2.6.2 硬度的测定 使用GY-3 型果实硬度计测定香蕉硬度。取香蕉果实，间隔等距离的三个位置，各削去一小块果皮（厚约 1 mm），用 GY-3 型果实硬度计测定各个位置果肉的硬度[17]。

1.2.6.3 可溶性固形物的测定 将香蕉用手持式糖度计测定香蕉可溶性固形物含量。取一定量（5.0 g）香蕉果实样品（果肉部分）放入研钵中磨碎后，经过离心（4000 r/min，10 min）后取汁液测定[17]。

1.2.6.4 可滴定酸的测定 在研钵中加入10.0 g 混匀的香蕉果肉磨碎，转入100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。静置30 min 后过滤。在三角瓶中加入20.0 mL 滤液，再加入2 滴1%酚酞，用已标定的氢氧化钠溶液进行滴定。滴定至溶液初显粉色并在半分钟内不退色时为终点（pH8.1～8.3），记录氢氧化钠滴定液的用量，重复三次。再以蒸馏水代替滤液进行滴定，作为空白对照[17]。

1.2.6.5 呼吸强度的测定 采用静置法测定香蕉呼吸强度。用移液管吸取10.0 mL 0.4 mol/L NaOH 放入培养皿中，将培养皿放到呼吸室底部（玻璃干燥器），放置隔板，装入1 kg 左右的香蕉，封盖，密闭半小时后取出培养皿，将碱液移入三角瓶中（冲洗3～4 次），加入5.0 mL 饱和BaCl2溶液和2 滴酚酞指示剂，用0.2 mol/L 草酸溶液滴定，用同样方法作空白滴定[17]。

1.3 数据处理

数据采用Origin 8.5 进行处理、作图。用SPSS 22.0 软件系统进行数据统计学分析。

2 结果与分析

2.1 镰刀菌的鉴定

分离纯化后的菌株B1 在PDA 固体培养基上培养7 d，菌落整体呈圆形，中间泛橙红色，边缘菌丝呈白色。第3 d 时菌落中心开始凹陷，边缘菌丝不断扩大，直径达36.8 mm。到第6 d，基本长满整个平板，在100 倍显微镜下观察，分生孢子呈镰刀状（图1）。

图1 病原菌菌落形态及显微形态Fig.1 Colony morphology and microscopic morphology of pathogenic bacteria

图2 中四种颜色波形代表四种碱基信号强弱，可以看出波峰和波谷较为清晰，峰与峰之间间隔较为均匀，没有套峰的出现且信号较强，由此证明数据准确度较高，可以进行下一步实验。

图2 碱基测序峰图Fig.2 Base sequencing peak diagram

由图3 显示，样品PCR 电泳图上有清晰的单条带扩增，通过与DNA Marker 比较，DNA 片段长度大小大约为750 bp。将测序得到的序列在NCBI 核酸数据库中比对，选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果。比对结果如图4 所示，该菌株B1 与Fusarium菌株序列同源为99.41%以上，其中与菌株MH045587.1 同源性高达99.8%，因此鉴定该菌株为镰刀菌（Fusarium incarnatum）。

图3 样品 PCR 电泳图Fig.3 PCR electrophoresis diagram of sample

图4 基于菌株B1 ITS 序列构建系统发育树Fig.4 Construction of the phylogenetic tree based on the ITS sequence of strain B1

2.2 不同浓度油茶皂素对镰刀菌的抑制作用

由图5 可以看出，5 mg/mL 的茶皂素对菌圈扩展的抑制率仅有52.99%，浓度为10 mg/mL 的时候抑菌率在74.65%，茶皂素对镰刀菌的抑制作用随浓度的升高而不断增强，浓度为20 mg/mL 时达到86.52%抑制镰刀菌的效果，之后浓度再升高抑菌率没有明显提升。

图5 不同浓度油茶皂素对镰刀菌的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of different concentrations of camellia saponin on Fusarium incarnatum

2.3 油茶皂素最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）结果

油茶皂素溶液对香蕉镰刀菌的MIC 为5 mg/mL（表2），表明较高质量浓度茶皂素溶液对香蕉镰刀菌的生长有抑制作用；对该菌的MBC 为10 mg/mL，表明较低质量浓度的茶皂素溶液只能抑制香蕉镰刀菌的生长，但要完全杀灭病原菌还需进一步提高其质量浓度。

表2 油茶皂素最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）Table 2 The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of camellia saponin

注：“+”表示平板上10 mm打孔菌饼四周有真菌生长；“−”表示平板上10 mm打孔菌饼四周无或有少量真菌生长。

2.4 不同浓度油茶皂素对香蕉失重率的影响

香蕉在保存过程中呼吸作用与蒸腾作用会造成水分流失，品质下降。失重率则是可以反映香蕉品质的指标之一[18]。如图6 所示。在整个贮藏期间，7 组香蕉失重率呈逐渐增加的趋势。贮藏第5 d 时，空白组失重率最高达27.13%，分别是15 mg/mL 油茶皂素处理组的2.86 倍，20 mg/mL 油茶皂素处理组的6.09 倍，25 mg/mL油茶皂素处理组的5.89 倍。30 mg/mL 油茶皂素处理组的6.35 倍。随着贮藏时间的增加，空白组失重率上升变缓慢，剩余各组在第10 d 失重率较为大幅增长。在第20 d 时，油茶皂素浓度为20、25 mg/mL 的处理组失重率分别为19.35%、14.37%，均低于其他各处理组，且与15、30 mg/mL油茶皂素处理组具有显著性差异（P<0.05），起到了延缓果实失重的效果；同时在第20 d，油茶皂素浓度为15 mg/mL 的处理组香蕉失重率为49.74%高于空白（34.67%），可能是由于油茶皂素浓度过低，起不到抑菌作用，反而促进香蕉果皮上的微生物的各种代谢活动，从而间接加强了香蕉自身代谢作用，促进了失重[19]。油茶皂素浓度为30 mg/mL 的处理组香蕉由于处理液浓度过高，可能诱起发酵，积累乙醇，挥发加速，促使失重率上升。贮藏至第20 d 和第25 d 时，20、25 mg/mL 油茶皂素处理组失重率显著低于阳性对照组（P<0.05）。

图6 不同浓度油茶皂素处理对香蕉失重率的影响Fig.6 The effect of different concentrations of camellia saponin on the weight loss rate of bananas

2.5 不同浓度油茶皂素对香蕉硬度的影响

硬度的变化是反映香蕉藏期内品质变化的重要指标之一[20]。不同浓度油茶皂素处理条件下香蕉果肉硬度的变化情况见图7。采后香蕉果实硬度在贮藏期内随着贮藏时间延长而不断下降。各油茶皂素处理组在第10 d 硬度均高于空白组（1.09 kg/cm2）。第15 d 后各处理组硬度持续下降。到第20 d，各个油茶皂素处理组的硬度均比空白组高，其中20 mg/mL油茶皂素处理组硬度最大为0.95 kg/cm2。由此证明油茶皂素处理与壳聚糖处理组可以减缓果实硬度的下降。

图7 不同浓度茶皂素处理对香蕉硬度的影响Fig.7 The effect of different concentrations of camellia saponin on the hardness of bananas

2.6 不同浓度油茶皂素对香蕉可溶性固形物的影响

香蕉贮藏过程中前期糖类以淀粉为主，在成熟过程转化为葡萄糖，可溶性固形物含量增加，果实成熟度升高，因此可溶性固形物反映香蕉贮藏期内品质变化[21]。由图8 所示，在整个贮藏期间各个香蕉处理组的可溶性固形物含量呈先上升后下降的趋势。在贮藏第5 d 时，每个处理组的可溶性固形物的含量都呈上升趋势，4 个浓度油茶皂素处理组均与空白组呈显著性差异（P<0.05）。在贮藏第10 d 空白组达到可溶性固形物含量高峰值20.29%，而15、20、25 mg/mL油茶皂素处理组和1%壳聚糖处理组均在第15 d 出现高峰值，分别为20.34%、20.28%、21.51%、20.58%，油茶皂素处理果实延缓了香蕉可溶性固形物含量高峰值的出现，对香蕉保鲜起到了一定的作用。

图8 不同浓度油茶皂素处理对香蕉可溶性固形物含量的影响Fig.8 The effect of different concentrations of camellia saponin on the soluble solid content of bananas

2.7 不同浓度油茶皂素对香蕉可滴定酸含量的影响

可滴定酸是评价水果品质的重要指标之一，果实中游离态的有机酸与糖一起影响果实的糖酸比，反映了果实的风味品质。由图9 可以看出采后香蕉可滴定酸含量整体呈先上升再下降的趋势，前期香蕉处于开始成熟阶段，有机酸积累较多，后期香蕉处于后熟阶段，糖的占比变大，有机酸开始减少。在采后第5 d，各组可滴定酸含量达到峰值，其中1%壳聚糖组的可滴定酸含量最高达1.16%，与其余各组差异不显著（P>0.05）。贮藏第10 d 各油茶皂素处理组（除15 mg/mL）与空白组相比具有显著性差异（P<0.05），且可滴定酸含量均高于阳性对照组（0.22%）。贮藏第25 d，空白组可滴定酸比原始下降了52.06%，各油茶皂素处理组可滴定酸含量均比空白组高，差异性显著（P<0.05）。油茶皂素处理香蕉可以有效延缓香蕉在贮藏期间可滴定酸的消耗，保持了香蕉果实的风味。

图9 不同浓度油茶皂素处理对香蕉可滴定酸含量的影响Fig.9 The effect of different concentrations of camellia saponin on the titratable acid content of bananas

2.8 不同浓度油茶皂素对香蕉呼吸强度的影响

呼吸强度是影响香蕉果实寿命的重要生理变化指标，呼吸强度的高低，影响香蕉营养物质的消耗快慢，即影响其贮藏期的长短[22]。不同浓度茶皂素处理条件下香蕉呼吸强度的变化情况见图10。各组香蕉果实的呼吸强度在贮藏期内，呈现先上升后下降的趋势，符合呼吸跃变型果蔬特点。前10 d，茶皂素浓度15 mg/mL、30 mg/mL、清水、1%壳聚糖、空白处理组均呈快速上升的趋势，且均在第10 d 出现呼吸跃变高峰，峰值分别为14.36、17.40、20.17、17.26、23.52 mg·h−1·kg−1·FW。原因可能是15 mg/mL 油茶皂素中活性成分较低，贮藏过程中对香蕉呼吸强度作用不明显；但15、30 mg/mL 油茶皂素处理组呼吸强度均显著低于清水、空白处理组（P<0.05）。20、25 mg/mL 浓度油茶皂素组延缓到第15 d 出现呼吸跃变高峰，峰值分别为16.74、14.43 mg·h−1·kg−1·FW，这时对比其他组，20、25 mg/mL 浓度油茶皂素组处理的香蕉内部物质消耗变慢，贮藏寿命相应延长。25 mg/mL 浓度油茶皂素与空白组呈显著性差异（P<0.05）。各处理组在出现呼吸高峰后，呼吸强度呈缓慢下降趋势，原因可能是香蕉果实成熟后，体内代谢发生变化，开始走向衰老，因此呼吸作用减少。

图10 不同浓度油茶皂素处理对香蕉呼吸强度的影响Fig.10 The effect of different concentrations of camellia saponin on the respiratory intensity of bananas

3 讨论

本文采集自然发病香蕉果实上的病原菌进行分离纯化，经形态和分子鉴定为香蕉镰刀菌（Fusarium incarnatum）。这与Abd M N B 等[23]从香蕉果实中分离出来的镰刀菌菌株鉴定结果一致。经研究发现茶皂素具有抑菌的功能，利用平板抑菌试验方法测定茶皂素溶液对香蕉镰刀菌的抑菌率。结果表明茶皂素对香蕉镰刀菌有较强的抑制作用。李芳等[24]利用5%辣椒碱加茶皂素微乳剂为抑菌剂对镰刀菌进行抑菌试验，结果表明该复合抑菌剂对镰刀菌有显著抑菌效果，并且抑菌率随着浓度的增加而升高，这种趋势与本试验结果相似，但起抑菌效果的茶皂素浓度却相差较大，分析原因可能有以下两点，一是由于所用茶皂素纯度不同或者是茶皂素来源不同（来源于不同的油茶品种或油茶不同部位），二是试验对象来源不同，镰刀菌具有一定差异。

不同浓度油茶皂素处理组对香蕉的各个品质指标都有不同程度的影响。其中当油茶皂素浓度为20 mg/mL 浓度时在贮藏20 d 与对照组（清水组和阳性对照组）相比失重率分别降低了48.04%、51.67%，表明油茶皂素能延缓香蕉失重率下降，这与李讯[19]研究结果相似，证明油茶皂素具有一定的保鲜作用。可溶性固形物相较于对照组（清水组）延缓了高峰值的出现；可滴定酸相较于对照组（清水组和阳性对照组）提高了56.09%、23.07%，在贮藏期间20 mg/mL浓度油茶皂素能延缓可滴定酸的消耗从而延长货架期；呼吸强度也相较于对照组（清水组和阳性对照组）增强了65.68%、14.82%；经过油茶皂素处理和1%壳聚糖处理过的香蕉果实在后期硬度明显下降平缓，这与Mirshekari 等[25]研究结论类似。其中最为明显的是在贮藏第10 d 时浓度为20 mg/mL 的油茶皂素处理组相较于对照组（阳性对照组）硬度提升了13.76%。结果表明20 mg/mL 浓度油茶皂素对采后香蕉的保鲜效果最佳。