金属有机骨架衍生氧化物材料作为MALDITOF MS 基质用于氨基酸分析

朱禹豪，杨亚非，曹东丽 ，夏 炎

（1.南开大学化学学院，南开大学中心实验室，天津 300071；2.天津市食品安全检测技术研究院，天津 300308）

氨基酸是蛋白质的基本组成单位，在大部分生命活动中发挥着重要作用[1]。机体中氨基酸的浓度变化与多种疾病有关，且能反映机体代谢情况。传统氨基酸分析方法大多存在预处理步骤复杂、分析成本高昂、分析时间长、样品需求量大等问题，因此，探究准确快速的分析氨基酸类物质的有效方法在疾病诊断和生命科学分析领域具有重要作用[2]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一种简单、高效的新型软电离质谱技术，以实验周期短、预处理步骤简单、样品消耗低、灵敏度高等优点，在蛋白质、肽链的分析中被广泛应用[3]，在氨基酸分析领域的拓展中有良好潜力。但在MALDI 的激光照射下，适用于大分子代谢物的传统基质本身也会发生电离破碎，在小分子范围内（<500 Da）产生严重信号干扰[4]。因此，用MALDITOF MS 直接进行小分子代谢物（100～500 Da）的检测是一项相对困难的工作。

近年来，研究者们拓展了诸如碳基材料[5]、纳米材料[6]、金属/金属氧化物材料[7−9]、金属有机骨架（metal-organic frameworks，MOFs）[10−12]、共价有机骨架（covalent-organic frameworks，COFs）[13]和MOF@COF[14]等材料作为MALDI-TOF MS 的新型基质材料用于检测小分子代谢物，其中，MOFs 和纳米金属氧化物材料由于其独特的性质受到了广泛关注。MOFs 的高孔隙率和大比表面积使得其作为基质易于与样品形成均匀分散的共结晶体系，材料在紫外范围的强激光吸收能力也符合MALDI 部分对激光能量吸收转移的要求；另外，由于MOFs 本身的多孔性、大比表面积、多活性位点、空间结构、易于修饰、组成元素多样性等特征，以MOFs 为模板/前驱体进行碳基材料[15]、金属氧化物材料[16−18]及其他衍生材料[17,19−22]的合成和应用也被广泛报道。金属/金属氧化物纳米材料具有与紫外光产生相互作用的能力，这使得金属/金属氧化物纳米材料具有作为MALDITOF MS 基质的应用潜力；最重要的是，该类材料作为基质可以很好地避免低质量区（100～500 Da）的自身干扰，在MALDI-TOF MS 小分子检测中有良好的应用前景[7,23−25]。其中，TiO2纳米粒子（nanoparticles，NPs）在紫外区表现出很强的吸收特性，相关文献也报道了通过TiO2NPs 复合各种基质[8−9,26−27]，例如：α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA）、2,5-二羟基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）及一些有较好应用的MOFs 等，制备出新型复合基质材料，在低质量区既能避免信号干扰，又能促进激光解吸电离过程，在MALDI-TOF MS 中取得了更好的应用检测效果。

本研究利用TiO2NPs 的优良特性，参考Dekrafft等[17]报道的一种简单、廉价、可调、可扩展的金属有机框架（MOFs）模板策略，经传统MOFs 修饰后再合成具有独特物理化学性质的混合金属氧化物纳米复合材料，作为MALDI 基质和吸附剂，用于高效分析氨基酸生物小分子。该金属氧化物纳米复合材料具有规则晶型的纳米级多孔结构，有助于其作为MALDI 基质与目标物形成均匀的共结晶体系，从而解决金属氧化物基质检测重现性差的问题，同时可显著提高氨基酸小分子目标物的电离效率和检测结果的信噪比，实现氨基酸类小分子代谢物的同时精确检测，拥有在MALDI-TOF MS 的小分子代谢物分析领域巨大的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脯氨酸（proline，Pro） 上海J&K 化工有限公司；异亮氨酸（isoleucine，Ile）、组氨酸（histidine，His）、色氨酸（tryptophan，Try）、对苯二甲酸（pphthalic acid，H2BDC）和硝酸铬（Chromium Nitrate，Cr（NO3）3） 天津光复精细化工研究所；氯化锆（Zirconium（IV）chloride，ZrCl4） 美国马萨诸塞斯特林试剂公司；中-四（4-羧基苯基）卟吩（meso-Tetra（4-carboxyphenyl）porphine，TCPP）、苯甲酸天津希恩思试剂公司；二（2-羟基丙酸）二氢氧化二铵合钛（Titanium（IV）bis（ammonium lactato）dihydroxide solution，TALH） 美国圣路易斯奥德里奇试剂公司；乙醇、乙腈（acetonitrile，ACN）、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF） 康科德试剂公司；氢氟酸（Hydrogen fluoride，HF） 天津市北联精细化工有限公司；纳米二氧化钛（Titanium Dioxide nanoparticles，TiO2NPs） 自制；去离子水（18.2 MΩ cm）天津理化分析中心；实验中所有试剂均为分析纯。

SmartLab X 射线衍射仪（采用λ=1.5418 Å Cu Kα射线，测试范围3～60°） 日本理学；Apreo S LoVac场发射扫描电子显微镜 FEI 捷克有限公司；Autoflex III TOF/TOF200 型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（采用波长为337 nm 的smartbeam 激光器）德国布鲁克；KH-400KDH 超声波清洗器 中国昆山禾创超声仪器有限公司；SX2-4-12 马弗炉 慧通五金（广州）电热设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金属有机骨架衍生氧化物材料制备

1.2.1.1 MIL-101（Cr）的制备 通过已报道的方法[10]来制备MIL-101（Cr），将80.0 mg 硝酸铬和332.0 mg对苯二甲酸溶于10.0 mL 去离子水中，滴加0.1 mL氢氟酸搅拌均匀，室温下用70 Hz 的超声波超声分散15 min 后，将所得溶液转移到聚四氟乙烯内衬的20 mL 不锈钢高压反应釜中，220 ℃下加热8 h。在8000 r/min 的转速下，离心15 min 并收集所得绿色固体，分别用DMF 和乙醇洗涤三次，离心，最后在60 ℃真空干燥过夜。取出称量得71.5 mg 绿色固体粉末产物。

1.2.1.2 UiO-66（Zr）的制备 通过已报道的方法[11]来制备UiO-66（Zr），将159.0 mg 氯化锆和102.0 mg对苯二甲酸溶于20.0 mL 的DMF 中搅拌均匀，室温下用70 Hz 的超声波超声分散15 min 后，将所得溶液转移到聚四氟乙烯内衬的50 mL 不锈钢高压反应釜中，120 ℃下加热24 h。在8000 r/min 的转速下，离心15 min 并收集所得白色固体，分别用DMF 和乙醇洗涤三次，离心，最后在60 ℃真空干燥过夜。取出称量得112.0 mg 白色固体粉末产物。

1.2.1.3 PCN-222（Zr）的合成 通过已报道的方法[28−29]来制备PCN-222（Zr），将18.8 mg 氯化锆、18.0 mg TCPP 和800.0 mg 苯甲酸溶于5.0 mL 的DMF 中搅拌均匀，室温下用70 Hz 的超声波超声分散15 min后，将所得溶液转移到聚四氟乙烯内衬的20 mL不锈钢高压反应釜中，120 ℃下加热48 h。在8000 r/min 的转速下，离心15 min 并收集所得紫色固体，分别用DMF 和乙醇洗涤三次，离心，最后在60 ℃真空干燥过夜。取出称量得20.0 mg 紫色固体粉末产物。

1.2.1.4 Cr2O3@TiO2的合成 参考文献[17]报道的方法模板化制备Cr2O3@TiO2。将合成好的MIL-101（Cr）粉末称取40.0 mg 溶于20.0 mL 0.1 mol/L HCl 溶液中，滴加1.3 mL TALH，充分搅拌后，室温下用70 Hz 的超声波超声分散30 min 使粉末在溶液中分散均匀。将溶液在室温条件下500 r/min 转速磁力搅拌2 h，得到泛白的绿色溶液。溶液在8000 r/min 的转速下，离心20 min 并收集所得绿色固体沉淀，将沉淀转移到坩埚中，放入马弗炉空气氛围下550 ℃煅烧16 h。取出称量得深绿色固体粉末11.0 mg。

1.2.1.5 （UiO-66）-ZrO2@TiO2的制备 参考文献[17]报道的方法模板化制备（UiO-66）-ZrO2@TiO2。将合成好的UiO-66（Zr）粉末称取70.0 mg 溶于35.0 mL 0.1 mol/L HCl 中，滴加1.2 mL TALH，充分搅拌后，室温下用70 Hz 的超声波超声分散30 min 使粉末在溶液中分散均匀。将溶液在室温条件下500 r/min转速磁力搅拌2 h，得到乳白色溶液。溶液在8000 r/min 的转速下，离心20 min 并收集所得白色固体沉淀，将沉淀转移到坩埚中，放入马弗炉空气氛围下550 ℃煅烧16 h。取出称量得灰白色固体粉末16.0 mg。

1.2.1.6 （PCN-222）-ZrO2@TiO2的制备 参考已报道的方法[17]模板化制备（PCN-222）-ZrO2@TiO2。将合成好的PCN-222（Zr）粉末称取20.0 mg 溶于15.0 mL 0.1 mol/L HCl 中，滴加1.0 mL TALH，充分搅拌后，室温下用70 Hz 的超声波超声分散30 min使粉末在溶液中分散均匀。将溶液在室温条件下500 r/min 转速磁力搅拌2 h，得到粉紫色溶液。溶液在8000 r/min 的转速下，离心20 min 并收集所得紫色固体沉淀，将沉淀转移到坩埚中，放入马弗炉空气氛围下800 ℃煅烧4 h。取出称量得白色固体粉末10.4 mg。

1.2.2 基质结构表征

1.2.2.1 SEM 表征 使用FEI 捷克有限公司Apreo S LoVac 场发射扫描电子显微镜，分辨率：0.7 nm@15 kV，1.0 nm@1 kV（高真空）；1.0 nm@15 kV，1.8 nm@3 kV（低真空）；0.8 nm@30 kV（stem）；加速电压：200 V～30 kV；电子枪：超稳定肖特基电子枪。

1.2.2.2 XRD 表征 使用日本理学SmartLab X 射线衍射仪，管压40 kV，管流150 mA，扫描速度15°/min，Cu Kα辐射，在3～60°角范围内获得了X 射线衍射（XRD）图。

1.2.3 MALDI-TOF MS 分析

1.2.3.1 用于MALDI-TOF MS 分析样品的准备将Pro、Ile、His、Try 溶解在去离子水中，浓度为0.1 mg·mL−1；Ile 和His 溶解在去离子水中，浓度为0.01、0.001 mg·mL−1。所得溶液在4 ℃的冰箱中存储，供进一步使用。

1.2.3.2 用于MALDI-TOF MS 分析的基质准备和点靶方法 将MIL-101（Cr）、UiO-66（Zr）、PCN-222（Zr）、Cr2O3@TiO2、（UiO-66）-ZrO2@TiO2、（PCN-222）-ZrO2@TiO2分散在乙腈中，浓度为0.1、0.01、0.001 mg·mL−1。将TiO2NPs 分散在乙腈中，浓度为0.1 mg·mL−1。

采用传统的干滴分析方法，使用MIL-101（Cr）、UiO-66（Zr）、PCN-222（Zr）、Cr2O3@TiO2、（UiO-66） -ZrO2@TiO2、（PCN-222） -ZrO2@TiO2、TiO2NPs 为基质时，将2 μL 待测物分析液与2 μL 基质混合，然后将2 μL 的混合物转移至金属靶上，待其自然晾干后进行测试。

1.2.3.3 MALDI-TOF MS 测试条件设置 MALDITOF MS 检测氨基酸使用的仪器为Bruker AutoflexⅢ质谱仪（德国），该仪器使用337 nm smartbeam 激光。在所有的实验中，使用正离子反射模式，80%激光强度进行检测。每个记录的质谱都是由200 个单独的200 Hz 激光发射的平均数据产生的。

1.3 数据处理

在目标物检测过程中，在同一个靶点中随机选取4 个点进行平行实验测试，所得数据使用Flex Analysis 和Origin 软件处理。

2 结果与分析

2.1 MOF-衍生金属氧化物的表征

在探究MOF-衍生金属氧化物作为基质辅助电离/解吸前，用XRD 和SEM（图1）对制备的MOF-衍生金属氧化物进行表征。由图可知，Cr2O3@TiO2的特征峰在24.5°、34°、36°、41.5°、50.5°、55°分别与Cr2O3（012）、Cr2O3（104）、Cr2O3（110）、Cr2O3（113）、Cr2O3（024）和Cr2O3（116）的平面相关[30]，在25°与TiO2（101）的平面相关[31]。（PCN-222）-ZrO2@TiO2与（UiO-66）-ZrO2@TiO2在25°、30°的特征峰分别与TiO2（101）[32]、ZrO2（101）[33]的平面相关。合成的三种MOF-衍生金属氧化物从XRD 图像上分析都与对应的M-Ti（M=Cr、Zr）氧化物峰相符，XRD表征符合预期设想。另外，在SEM 下的三种MOF-衍生金属氧化物都呈大小近似球形的颗粒状物，其中，两种小配体（对苯二甲酸）的MOF-衍生金属氧化物（Cr2O3@TiO2、（UiO-66）-ZrO2@TiO2）颗粒少量堆积形成丰富的多孔结构，而大配体（TCPP）的MOF-衍生金属氧化物（（PCN-222）-ZrO2@TiO2）颗粒则大量聚集形成大孔隙的多孔结构。孔隙产生的原因可能在于高温焙烧下有机配体的离去，形貌表征也符合预期设想，表征结果表明材料合成成功。

图1 三种MOFs 基质的SEM 和XRD 表征Fig.1 SEM and XRD characterization of three MOFs matrix

2.2 MOF-衍生金属氧化物作为MALDI-TOF MS 基质的探究

参考评估MOF-衍生金属氧化物作为MALDI基质检测氨基酸类小分子的表现[31,34−39]，选择4 种氨基酸（Pro、Ile、His 和Try）作为目标分析物（图2）进行MALDI-TOF MS 分析。

在进行MALDI-TOF MS 分析检测时，正离子模式下，样品常出现正离子加合峰，如加质子峰、加H+峰、加碱金属离子峰（Na+或K+）、减电子峰等。图3 为正离子模式下使用0.1 mg·mL−1三种MOFs（MIL-101（Cr）、PCN-222（Zr）、UiO-66（Zr）），作为基质用于MALDI-TOF MS 检测0.1 mg·mL−1四种氨基酸的结果。三种MOFs 基质都在138.41（Pro 的[M+Na]+）、154.36（Ile 的[M+Na]+和Pro 的[M+K]+）、194.31（His 的[M+K]+）、243.30（Try 的[M+K]+）处产生清晰的正离子峰（表1），四种氨基酸均有特征峰被检出，但三种基质的质谱图背景不干净，信噪比较低，且目标峰强度也不高。

如图4 所示，三种MOF-衍生金属氧化物在同等检测条件下相比其前驱体MOFs 对四种氨基酸都有明显更强的质谱信号检出，信号强度和信噪比均提升了数倍到数十倍不等，且三种衍生金属氧化物都检测到清晰的碱金属加合峰（表1）。其中，Cr2O3@TiO2（图4A）对194.32 m/z 和178.36 m/z 检出信号强度相较其他衍生金属氧化物较强，且整体检出强度和信噪比都较好；（PCN-222）-ZrO2@TiO2（图4B）检测效果相较于其前驱体MOFs 有明显提升，但提升效果不如Cr2O3@TiO2基质（图4A）；而（UiO-66）-ZrO2@TiO2（图4C）峰强度较前驱体MOFs 虽有提升，但信噪比与其他衍生金属氧化物相比稍差。

图4 三种MOFs 及其衍生金属氧化物（0.1 mg·mL−1）对4 种氨基酸的质谱检测信号对比Fig.4 Comparison of the mass spectrometry of four amino acids in three MOFs matrix (0.1 mg·mL−1) and three MOFderived oxides metal matrix (0.1 mg·mL−1)

表1 各种基质对四种氨基酸的检出表（正离子模式）Table 1 The table of four amino acids detected by various substrates (positive ion mode)

如图5 所示，与TiO2NPs 相比，MOF-衍生金属氧化物各目标峰检出情况虽然有所差别，但所有目标峰均有检出，信噪比和强度也较高，整体检出效果相较于TiO2NPs 略微提升。这一结果应证了模板化合成的MOF-衍生金属氧化物继承了TiO2NPs 作为基质辅助分析物电离的优良效果，并且还具有更高的电离分析物效率。

图5 三种MOF-衍生金属氧化物（0.1 mg·mL−1）和TiO2 对4 种氨基酸的质谱检测信号对比Fig.5 Comparison of the mass spectrometry of four amino acids in three MOF-derived metal oxides matrix (0.1 mg·mL−1)and TiO2 NPs matrix (0.1 mg·mL−1)

2.3 基质用量对质谱峰强度的影响

质谱中峰的高度与被测物的丰度有关，基质辅助被测物离子化效率越高，被测物进入探测器的丰度越高，峰强也就越高。由图6 可知，Cr2O3@TiO2和（PCN-222）-ZrO2@TiO2基质在0.001～0.1 mg·mL−1的浓度范围内，基质浓度的提升，增强了分析物的电离效率，但较高的基质浓度使基质与分析物结晶层变厚，激光不易于充分电离分析物与基质的共结晶，因此电离效率提升并未呈线性增长。（UiO-66）-ZrO2@TiO2基质未出现类似变化，但该基质在低浓度条件下针对四种氨基酸的电离效率明显高于其他两种MOF-衍生金属氧化物。

图6 不同浓度的Cr2O3@TiO2 （A）、（PCN-222）-ZrO2@TiO2（B）和（UiO-66）-ZrO2@TiO2（C）对4 种氨基酸的质谱检测信号对比Fig.6 Comparison of the mass spectrometry of four amino acids in different matrix concentrations of Cr2O3@TiO2 (A),(PCN-222)-ZrO2@TiO2 (B) and (UiO-66)-ZrO2@TiO2 (C)

2.4 重现性与定量分析

到目前为止，已经开发出的金属氧化物[7−9]和MOFs[10−11]基质中，只有在基质和分析物在局部形成的共结晶（即“甜点”）处才能获得较好的检测结果，阻碍了MALDI-TOF MS 在定量分析方面的应用。因此，本文中进行了MOF-衍生金属氧化物重现性的分析工作，探究该新型基质材料在MALDI-TOF MS 检测中是否具有对氨基酸类小分子较好的定量分析应用前景。

重复性通过采集3 个MOF-衍生金属氧化物样品的4 个随机区域的数据进行评估（图7），并将结果与TiO2NPs 基质样品作比较。从信号强度上看，MOF-衍生金属氧化物比TiO2NPs 基质具有更好的重现性，在样品的不同区域上得到的信号峰强度差别不大。

从信噪比（表2）上分析，采用了4 个样品在正离子模式下的信噪比相对标准偏差（RSDs）（n＝5）进行比较。表中可以看到，三种MOF-衍生金属氧化物各个目标峰的RSD 都要明显低于TiO2NPs（Cr2O3@TiO2在243.30 m/z 的信噪比RSD 20.74%除外）。值得注意的是，三种合成材料基质在某些目标峰检出上有一定良好重现性表现：如Cr2O3@TiO2在138.41 m/z（Pro）、154.36 m/z（Pro、Ile）的信噪比RSD 只有4.72%和2.56%；（PCN-222）-ZrO2@TiO2在154.36 m/z（Pro、Ile）的信噪比RSD 为8.62%；（UiO-66）-ZrO2@TiO2在227.34 m/z（Try）的信噪比RSD 只有3.94%。

表2 MOF-衍生金属氧化物样品和TiO2 NPs 检测4 种氨基酸信噪比RSDTable 2 S/N RSD of four amino acids using MOF-derived metal oxide and TiO2 NPs as matrix

进一步以Ile 和His 作为目标小分子，探究Cr2O3@TiO2基质的定量分析能力。不同浓度的Ile 和His在0.1 mg·mL−1Cr2O3@TiO2基质作用下的质谱结果如图8 所示（S/N>10）。质谱峰信号强度和氨基酸的浓度呈线性关系（图9）：在正离子模式下，Ile 的线性浓度范围为0.001～0.1 mg·mL−1（R2=0.9997）；His的线性浓度范围为0.001～0.1 mg·mL−1（R2=0.9997）。

图8 不同浓度Ile 和His 在Cr2O3@TiO2 基质作用下的质谱信号Fig.8 The mass spectrometry of Ile and His at different concentrations using Cr2O3@TiO2 as matrix

图9 Ile（A）与His（B）的线性关系图（以Cr2O3@TiO2 为基质，测定不同浓度的分析物）Fig.9 Linear relationship plots of Ile (A) and His (B)(Cr2O3@TiO2 was used as matrix for the determination of different concentrations of analytes)

2.5 分析方法对比

综合数据分析，MOF-衍生金属氧化物相较于原MOFs 和TiO2NPs 作为基质在MALDI-TOF MS 分析中具有信号强度和信噪比上的优越性。其中，用Cr2O3@TiO2基质定量检测Ile 和His，并与其他方法做了比较（表3），说明Cr2O3@TiO2基质在Ile 和His 定量检测上有更好的应用前景。

表3 不同方法对Ile 和His 的检测能力比较Table 3 Comparison of detection ability of different methods for Ile and His

3 结论

本文从模板化合成涂覆TiO2的MOF-衍生金属氧化物材料入手，探究该材料作为基质在MALDITOF MS 检测氨基酸类小分子代谢物中的效果。结果表明，MOF-衍生金属氧化物材料在去除MOFs 有机结构的同时保持其结构特性，一方面消除该类基质在MALDI-TOF MS 分析中低分子量区域内的基质干扰，另一方面保留MOFs 及TiO2纳米粒子本身的基质特性。这种材料解决了金属氧化物基质检测重现性差的问题，作为MADLI 基质相比原MOFs 及TiO2纳米粒子在对氨基酸类小分子进行分析时表现出更优秀的性能，可以明显提高小分子目标物的电离效率和检测结果的信噪比，实现氨基酸类小分子代谢物的同时精确检测，具有进一步拓展和应用的价值。