UPLC法测定覆盆子中科罗索酸和齐墩果酸的含量

李 静，朱婉萍，王昱霁

(1.浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州 310053；2.椒江绿康老年康复护理院，浙江 台州 318000；3.浙江省中医药研究院，浙江 杭州 310007)

覆盆子为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)植物华东覆盆子的聚合果[1]。作为中药材，覆盆子具有益肾固精缩尿、养肝明目等功效，临床用于治疗遗精滑精、遗尿尿频、阳痿早泄、目暗昏花等症状[2]。现代研究证明，覆盆子含有多糖、萜类、糖蛋白、黄酮、甾醇、生物碱、香豆素和酚酸等化合物[3-8]，已明确有活性的成分包括鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷、β-谷甾醇、齐墩果酸、覆盆子素、槲皮素等。目前未见到有学者对其活性三萜类成分科罗索酸和齐墩果酸进行UPLC的含量测定，作者对覆盆子中的科罗索酸和齐墩果酸成分进行方法学验证，并对不同产地的覆盆子进行相关含量测定，为覆盆子的质量控制提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

超高压液相色谱仪：Waters UPLC H-Class；分析天平：Sartorius，BT 25 S；分析天平：Mettler Toledo，MS204S；超声波清洗器：宁波新芝生物科技股份有限公司，SB-52000。

1.2 试药

科罗索酸(98%，CX0060，江苏永健医药科技有限公司)；齐墩果酸(91.6%，200167-190302，江苏永健医药科技有限公司)；乙醇(分析级：成都市科隆化学品有限公司，2019050902)；甲醇(色谱级：Merck，I837107623)；磷酸：(分析级：成都市科隆化学品有限公司，2019010201)；覆盆子样品(浙江台州的采摘自浙江台州华宇农场掌叶覆盆子基地)，其他的覆盆子样品采购自多个药材市场，经浙江中医药研究院鉴定为蔷薇科植物华东覆盆子(RubuschingiiHu)的果实。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

使用UPLC测定，色谱柱 Waters UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；流动相甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脱，梯度洗脱变化见表1；检测波长为210 nm；进样量2 μL；流速0.4 mL/min；柱温35 ℃。科罗索酸、齐墩果酸与相邻色谱峰的分离度应大于1.5，理论塔板数应不低于3 000，色谱见图1。

表1 科罗索酸、齐墩果酸梯度洗脱程序

注：科罗索酸出峰时间：3.446；齐墩果酸出峰时间：4.806。

2.2 对照品溶液制备

精密称取科罗索酸标准品1.66 mg、齐墩果酸标准品2.37 mg，于10 mL量瓶甲醇定容，制成含科罗索酸0.166 mg/mL、齐墩果酸0.237 mg/mL的对照品溶液。

2.3 样品溶液制备

取过四号筛的覆盆子干燥样品粉末2 g，精密称定，加甲醇60 mL，称重，超声1 h，至室温后用甲醇补足失重，摇匀，滤过。滤液减压蒸干，称取适量提取物用甲醇溶解并于10 mL量瓶定容，配制成浓度约为4 mg/mL的供试品液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密量取科罗索酸、齐墩果酸对照品溶液0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、2.5 mL、5 mL置于5 mL量瓶中，用甲醇稀释定容，用0.22 μm微孔滤膜过滤后即得混标供试品。按“2.1”项下项色谱条件，UPLC进样量2 μL，检测并记录谱图及峰面积，以浓度为横坐标(x)峰面积为纵坐标(y)进行回归。得科罗索酸标准曲线：y=907 961.402 8x+336.881 3，R2=0.999 4，见表2、图2；齐墩果酸标准曲线：y=1 191 439.354 7x-1 105.288 0，R2=0.999 7，见表3、图3。分别在0.001 627～0.081 34 mg/mL、0.002 171～0.108 6 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

表2 科罗索酸对照品浓度与峰面积数据

图2 科罗索酸标准曲线

表3 齐墩果酸对照品浓度与峰面积数据

图3 齐墩果酸标准曲线

2.4.2 精密度试验 取科罗索酸、齐墩果酸对照品溶液0.4 mL，置于2 mL量瓶中用甲醇定容，0.22 μm微孔滤膜过滤后按“2.1”项色谱条件，连续进样6次，得科罗索酸峰面积的RSD为0.79%，齐墩果酸峰面积的RSD为1.5%，表明仪器精密度良好，见表4。

表4 科罗索酸、齐墩果酸精密度试验结果

2.4.3 重复性试验 精密称定同一过四号筛的覆盆子样品粉末6份，按“2.3”项下制备供试品液，按“2.1”项色谱条件进样，得科罗索酸提取物含量的RSD为1.710%，齐墩果酸提取物含量的RSD为1.609%，表明该方法重复性良好，见表5。

表5 科罗索酸、齐墩果酸重复性试验结果

2.4.3 重复性试验 精密称定同一过四号筛的覆盆子样品粉末6份，按“2.3”项下制备供试品液，按“2.1”项色谱条件进样，得科罗索酸提取物含量的RSD为1.710%，齐墩果酸提取物含量的RSD为1.609%，表明该方法重复性良好，见表6。

表6 稳定性试验结果

2.4.5 加样回收率试验 取已知含量的覆盆子粉末6份，每份约1 g精密称定，分别加入科罗索酸、齐墩果酸适量，加甲醇30 mL，其他按“2.3”项下操作，制备供试品液，按“2.1”项色谱条件进样，得科罗索酸含量的RSD为1.924%，齐墩果酸含量的RSD为1.722%。所得结果见表7。

表7 加样回收率试验结果

2.4.6 样品含量测定 精密称定不同产地的覆盆子样品，打粉，过四号筛，按“2.3”项下制备不同产地的覆盆子供试液，按“2.1”项色谱条件进样，测定科罗索酸、齐墩果酸含量，结果见表8。

表8 不同产地覆盆子中的科罗索酸、齐墩果酸含量 (μg/g)

3 讨论

3.1 检查对象的选择

覆盆子中的三萜类物质具有多种药理活性，作者希望能建立覆盆子药材中科罗索酸和齐墩果酸的UPLC含量测定方法，控制其质量，为种植研究及工艺研究提供依据。

3.2 色谱条件的选择

在参考文献[9-11]的基础上先进行HPLC的试验，因保留时间长，改用UPLC进行，希望改进试验速度。流动相的选择，分别进行了甲醇、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水作为流动相进行相关试验，结果显示，甲醇-0.2%磷酸溶液的分离度最好，效果最佳。柱温选择，因柱温对科罗索酸和齐墩果酸的分离度影响不大，最终选择了35 ℃作为色谱柱的柱温。检测波长的选择，根据文献结果，对波长进行复查，最终选取响应值最大的210 nm作为测定波长。流速的选择，分别进行了1、0.8、0.6、0.4 mL/min的流速试验，结果显示，0.4 mL/min的流速分离度适中，用时最短。流动相梯段时间的选择，对流动相梯度进行多个时间设定的对比，选择能有效去除杂质，并且保持合适目标分离度的梯度时间，结果显示使用正文中的流动相，分离效果最佳。

3.3 提取条件的选择

在提取方法上，分别对覆盆子进行了超声提取和加热回流提取的比较，以含量为考察指标，结果表明，超声提取得到的科罗索酸、齐墩果酸含量更高。在提取溶剂的选择上，参考曹富等[11]的研究，选择了提取效率较高的甲醇作为提取溶剂。提取工艺的选择考虑取溶剂浓度、醇提次数、提取时间、加醇量等因素的影响，参考制剂提取工艺的L16(45)正交试验结果，以及标准曲线的定量限范围，确定“2.3”项下的样品溶液制备方法。

4 结语

试验采用UPLC法同时测定覆盆子萜类成分中科罗索酸和齐墩果酸的含量，为建立覆盆子的质量控制提供依据。该检测方法可以有效测定不同产地覆盆子中科罗索酸和齐墩果酸的含量，检测结果分别在0.001 627～0.081 34 mg/mL、0.002 171～0.108 6 mg/mL范围内呈良好的线性关系。该方法灵敏、便捷、准确、稳定，可用于覆盆子药材的质量评价。