添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对绵羊瘤胃体外发酵的影响

高俊玲，甄玉国，2，王涛，2，孙喆，2，3，张学峰，2

（1.吉林农业大学 动物科学技术学院 吉农博瑞奶牛科技研发中心 吉林省动物营养与饲料科学重点实验室 动物生产及产品质量安全省部共建教育部重点实验室，吉林长春 130118；2.长春博瑞科技股份有限公司 博士后科研工作站吉林省饲料工程技术研究中心，吉林长春 130118；3.吉林农业大学 生命科学技术学院，吉林长春 130118）

抗菌肽（AMPs）作为一种小分子多肽物质，具有广谱的抗真菌、细菌、病毒、寄生虫以及不易产生耐药性的优点，因此成为最有潜力的抗生素替代品之一（王亚平等，2018）。覃小荣等（2011）用保育猪作为试验动物来研究抗菌肽替代抗生素对其生长性能与健康的影响，结果表明，饲喂添加0.5%抗菌肽基础日粮的保育猪生长效果最好，并且添加0.1%抗菌肽与添加0.3%阿莫西林有相同的饲喂效果。徐博成等（2020）研究抗菌肽对仔猪生长性能、腹泻率和血液免疫指标的影响，结果表明饲粮添加抗菌肽可以提高仔猪的生长性能和免疫功能，并可降低腹泻率。三丁酸甘油酯（TB）是一种丁酸前体物，能够促进肠道发育，改善生长性能，调节肠道微生物菌群（Bedford等，2018），因此成为一种潜在的抗生素替代品。Hou 等（2006）研究表明，日粮中添加三丁酸甘油酯可以提高饲料效率，增加回肠绒毛高度，提高空肠乳糖酶、蔗糖酶和麦芽糖酶活性。张勇等（2016）研究表明，在饲粮中添加0.1%三丁酸甘油酯可以提高仔猪的生长性能，增加血清中IgA、IgG 和IgM 含量。但目前对于抗菌肽和三丁酸甘油酯这两种添加剂的研究大多集中于单胃动物，对于反刍动物的研究比较少，本试验旨在探讨抗菌肽和三丁酸甘油酯对绵羊体外瘤胃发酵的影响，为其在反刍动物的应用上提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验所用抗菌肽由英惠尔生物科技有限公司（中国北京）提供，三丁酸甘油酯由瑞典柏斯托公司提供。

1.2 试验设计 本试验采用单因素试验设计，选用3 只体况良好、体重为（40±2）kg 装有永久性瘤胃瘘管的绵羊作为试验动物。饲粮精粗比为50：50，其组成与营养水平如表1 所示。将采集的瘤胃液混匀后分为4组，即对照组（A 组）、抗菌肽组（B组，添加0.03%抗菌肽）、三丁酸甘油酯组（C组，添加0.15%三丁酸甘油酯）和联合使用组（D组，添加0.03%抗菌肽+0.15%三丁酸甘油酯），每组每个时间点4 个重复，体外发酵试验在6、12 h和24 h 进行样品采集。

表1 日粮组成和营养水平

1.3 体外发酵试验

1.3.1 瘤胃液的采集与缓冲液的配制 晨饲前，采用硬质PVC 取样管从瘤胃内不同位置采取瘤胃液，将其迅速混匀，倒入用热水预热后的保温瓶中，迅速盖好瓶盖带回实验室。将瘤胃液用4 层纱布过滤，置于39 ℃并无氧的暖瓶中备用。瘤胃液缓冲液的配制参照MenKe 等（1979）的方法，试验开始前1 h 将缓冲液混匀并通入CO2至无色，放入39 ℃的水浴中预热。

1.3.2 体外培养 参照MenKe 等（1988）的体外培养方法，将过滤后的瘤胃液与缓冲液按照1：2的比例混匀加入培养瓶中，持续通入CO230 s，立即盖上瓶盖放入培养箱中培养。

1.3.3 样品采集 体外发酵培养过程中，分别在6、12、24 h 取出培养瓶，停止发酵，立即用便携pH 计测定发酵液pH，并收集发酵液将其放置于-20 ℃冰箱保存，用于测定挥发性脂肪酸（VFA）和氨态氮（NH3-N）。

1.4 测定指标及方法 干物质降解率参照郭晨阳等（2020）的方法，pH 用便携式pH 计测定，NH3-N 浓度参照冯宗慈等（2010）改进的比色法测定，VFA 参照周雪飞（2016）的方法测定。

1.5 数据处理与分析 采用Excel 2010 对数据进行初步整理后，采用SPSS 18.0 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan’s 法多重比较，P ﹤0.05 为差异显著。试验结果以折线图和柱状图表示。

2 结果与分析

2.1 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对pH 和NH3-N 的影响 由图1 可知，在整个体外发酵培养过程中，pH 在不同时间点各组之间差异均不显著（P ﹥0.05）。由图2 可知，各个处理组NH3-N 浓度随着发酵时间的增加而呈现逐渐增加的趋势，24 h时D 组瘤胃发酵液中NH3-N 的浓度极显著高于A、B、C 三组（P ﹤0.01），并且B 组NH3-N 的浓度低于A组，C 组NH3-N 的浓度高于A 组。在6 h 和12 h 时各组之间差异均不显著（P ﹥0.05）。与对照组相比，添加抗菌肽有降低NH3-N 浓度的趋势，添加三丁酸甘油酯有增加NH3-N 浓度的趋势。

图1 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对pH 的影响

图2 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对NH3-N 的影响

2.2 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对干物质降解率和发酵产气量的影响 由图3 可知，在6 h 和12 h时，各组之间干物质降解率均没有显著性差异（P﹥0.05），在24 h时，B、C 组干物质降解率高于对照组，但差异不显著（P ﹥0.05），D 组干物质降解率显著低于A、B、C 三组（P ﹤0.05）。由图4 可知，在整个体外发酵培养过程中，发酵产气量各组之间在不同时间点差异均不显著（P ﹥0.05）。

图3 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对干物质降解率的影响

图4 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对产气量的影响

2.3 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对VFA 的影响由图5～10 可知，在6 h时，B、D 组瘤胃发酵液中乙酸和丁酸的浓度显著高于对照组A 组（P ﹤0.05），异戊酸浓度D 组显著高于A 组（P ﹤0.05），戊酸浓度B 组显著高于A 组（P ﹤0.05）。在12 h时，B 组瘤胃发酵液中戊酸的浓度显著小于A、C、D三组（P ﹤0.05），其余各个指标在12 h 时各组之间差异均不显著（P ﹥0.05）。在24 h时，A、B、C 三组总挥发性脂肪酸浓度显著高于D组，B、C 组乙酸浓度显著高于D 组（P ﹤0.05），A、B、C 三组丙酸、丁酸和异戊酸浓度显著高于D 组（P ﹤0.05），其余各组之间差异不显著（P ﹥0.05），戊酸浓度在24 h时各组之间差异不显著（P ﹥0.05）。

图5 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对总挥发性脂肪酸的影响

图6 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对乙酸的影响

图7 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对丙酸的影响

图8 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对丁酸的影响

3 讨论

图9 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对异戊酸的影响

图10 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对戊酸的影响

3.1 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对pH 的影响瘤胃内pH 是维持瘤胃微生物正常生长繁殖的重要条件，经常受到精粗饲料比、日粮干物质水平和饲料加工处理等因素影响（王庆丽等，2008），其正常值一般在6.0～ 7.0 波动，高于或低于正常范围都会直接影响瘤胃的发酵情况和瘤胃内微生物的生长繁殖情况，本试验中各组瘤胃发酵液的pH在正常范围内波动，并且随着发酵时间的增加pH逐渐下降，24 h 时pH 降到最低，可能是因为培养瓶内的有机酸积累所致。

3.2 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对NH3-N 的影响 氨氮（NH3-N）是瘤胃氮素循环过程中蛋白质被生物降解和再利用过程中的中间产物，与非蛋白氮或饲料蛋白质的降解速率、菌体蛋白合成速率、能量和碳架供给有关，其正常浓度为8.5～30 mL/100 mL（王敬尧等，2020）。Liu等（2017）研究发现，与对照组相比，添加抗菌肽可以显著降低瘤胃发酵液中NH3-N 浓度，与本试验结果相似。在本试验中，12 h 和24 h时，添加抗菌肽的瘤胃发酵液中NH3-N 浓度要低于对照组，其原因可能是抗菌肽提高了瘤胃微生物对NH3-N 利用效率，从而使NH3-N 合成了较多的菌体蛋白，这与高爽等（2017）研究发现日粮中添加复合抗菌肽会显著增加山羊瘤胃中菌体蛋白含量的结果一致。在本试验中，12 h 和24 h时，添加三丁酸甘油酯的瘤胃发酵液中NH3-N浓度要高于对照组，可能是因为三丁酸甘油酯可以提高日粮粗蛋白质的降解率，这与Ren 等（2018）研究发现补充三丁酸甘油酯可以提高成年绵羊瘤胃日粮粗蛋白质的降解率的结果一致。但是同时添加这两种物质其NH3-N 浓度显著高于对照组，可能是因为两种物质在瘤胃发酵液中对NH3-N 发生正向作用。

3.2 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对干物质降解率和发酵产气量的影响 干物质降解率是指在体外发酵培养过程中瘤胃内微生物对发酵底物的利用程度（杨晶晶，2020）。刘靖康（2018）研究表明添加抗菌肽CC31 可以显著提高羔羊瘤胃内干物质消化率，与本试验结果一致，在本试验中，24 h 时添加抗菌肽瘤胃内干物质降解率高于对照组，可能是因为抗菌肽抑制了有害菌的生长，从而促进了有益菌群对营养物质的吸收利用率提高所致。在本试验中，24 h 时添加三丁酸甘油酯显著提高了瘤胃内干物质降解率，这与Huhtanen 等（1993）研究发现提高奶牛瘤胃中丁酸的浓度可以提高日粮干物质的降解率的结果一致，可能是因为三丁酸甘油酯改变了瘤胃内酶的活性。但是同时添加这两种物质其干物质降解率显著小于对照组，其原因可能是两种物质在瘤胃内呈负相关作用。

评价饲料发酵程度的一个重要指标就是体外发酵产气量。在本试验中，24 h时，添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对于发酵产气量的影响与干物质降解率的结果相似，两种物质单独添加都有增加发酵产气量的趋势，同时添加有减少发酵产气量的趋势。

3.3 添加抗菌肽和三丁酸甘油酯对VFA 的影响瘤胃中碳水化合物发酵后所产生的VFA 是反刍动物重要的能量来源，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，约占总挥发性脂肪酸的95%（李文，2014）。有研究发现，在饲粮中添加抗菌肽可以增加瘤胃发酵液中乙酸、丙酸和丁酸的含量（张萌萌，2020；李世易，2019；Jalc等，2002），与本试验结果一致，在本试验中，24 h时，添加抗菌肽增加了乙酸、丙酸和丁酸的浓度，是因为添加抗菌肽可以影响瘤胃微生物菌群的结构（Ren等，2019）。有研究表明，在日粮中添加三丁酸甘油酯可以增加瘤胃内乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等挥发性脂肪酸的含量（宋志华等，2020；Ren等，2018），这与本试验结果一致，在本试验中，24 h时，与对照组相比，添加三丁酸甘油酯增加了瘤胃内发酵液中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的含量，其原因可能是三丁酸甘油酯增加了纤维降解酶的活性（Ren等，2018），纤维降解酶在饲粮碳水化合物的降解中发挥着重要作用（Santra等，2007）。但是在本试验中，两者都添加时，乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸都显著降低，其原因可能是添加的剂量不太合适，使其在瘤胃发酵液中发生负向作用。

4 结论

在本试验条件下，添加抗菌肽和三丁酸甘油酯可以促进瘤胃发酵功能，但同时添加时，不利于瘤胃发酵。