一株野生泡囊侧耳的鉴定及生物学特性研究

肖玉军 孔令家 黄中华 杨 梅 唐莉静 柳成益

（攀枝花市农林科学研究院，四川攀枝花 617001）

侧耳属真菌分布非常广泛，是世界上主要人工栽培的食用菌之一，具有重要经济价值[1]。泡囊侧耳Pleurotus cystidiosus，又名鲍鱼菇、台湾平菇、栎侧耳等，隶属于担子菌亚门Basidiomycotina、层菌纲Hymenomycetes、伞菌目Agaricales、口蘑科Tricholomataceae、侧耳属Pleurotus[2]，是一种食药兼用的珍稀菌类之一。泡囊侧耳是中高温木腐型食用菌，主要分布在亚热带和热带地区，中国主要分布于台湾地区、福建省、浙江省等[3]。研究表明，泡囊侧耳含有丰富的营养成分[4-6]和多种生物活性物质，具有抗肿瘤[7]、抗氧化[8-9]，抑菌[10]和降血糖[11]等功效，具有较高的药用价值。

目前，对泡囊侧耳的研究主要集中于栽培技术和栽培料配方，营养成分、活性物质、药理功效等方面及野生种质资源收集驯化方面研究报道较少[3]。由于野生泡囊侧耳种质资源稀缺，产量低，致使可供人工栽培的品种少，一定程度上制约了其产业化和规模化发展，无法满足市场需求。因此，挖掘和开发利用泡囊侧耳优质野生资源是解决该问题的主要途径之一。笔者对采自四川省攀枝花市农林科学研究院芒果种质资源圃的一株野生侧耳菌株，进行形态特征和ITS 基因测序分析分类鉴定；同时对该菌株的生物学特性开展研究，为该菌株进一步驯化栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

（1）供试菌株

供试野生侧耳子实体采自四川省攀枝花市农林科学研究院芒果种质资源圃，组织分离法[12]分离培养得纯化菌株。

（2）供试培养基

综合PDA 培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨 3 g，磷酸二氢钾 2 g，硫酸镁 1 g，琼脂18 g，水1 L，pH自然。

基础培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氢钾1.5 g，硫酸镁0.75 g，琼脂18 g，水1 L，pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株形态学鉴定

参照真菌图谱等工具书，对新鲜子实体的形状、颜色、菌盖直径、菌盖厚度、菌柄长度和菌柄直径等进行观察、测量和拍照，初步鉴定其分类地位。

1.2.2 分子生物学鉴定

将分离的菌株进行纯培养，待菌丝将要长满时进行DNA 提取，DNA 提取参照柴海云的方法[13]。以提取的基因组DNA 为模板，以真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG- 3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'）为 引 物[14]，进 行PCR 扩增，反应体系和反应程序参照张妍等[15]方法，PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

登陆GenBank，将测定的序列经BLAST比对，对菌株进行同源性比较分析，在GenBank 中下载相似性较高的序列，用MEGA X 进行系统发育分析和进化树构建，以Schizophyllum、Tricholoma为外群，用N-J 法（Neighbor-Joining method）构建分子进化树，进行1 000次自展抽值检验分子进化树可靠性。

1.2.3 生物学特性研究

1.2.3.1 培养基碳源试验

分别用等质量的半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、木糖、羧基纤维素钠、甘露醇、山梨醇和肌醇来代替供试基础培养基中的葡萄糖，每个处理5 次重复。培养基接种供试菌株后，于25 ℃恒温箱暗光培养。参照高阳等[16]的方法，每天观察菌丝长势，测量菌落直径，计算菌丝平均生长速度。

菌丝平均生长速度（mm/d）=（平均菌落直径-5）/菌丝生长时间。

1.2.3.2 培养基氮源试验

分别用等质量牛肉粉、大豆蛋白胨、麦芽浸粉、甘氨酸、酵母粉和胰蛋白胨来代替供试基础培养基中的蛋白胨，每个处理5 次重复。培养基接种供试菌株后，于25 ℃恒温箱暗光培养。菌丝生长观察方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 培养温度试验

采用综合PDA 培养基。试验培养温度设置为15 ℃、18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃共8 个温度处理，接种后于恒温箱暗光培养菌丝。每个处理5次重复。菌丝生长观察方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 培养基pH试验

用1 mol/L 盐酸和1 mol/L 的氢氧化钠将综合PDA 培养基初始pH 调为5、6、7、8、9、10，每个处理5次重复。接种后于25 ℃恒温箱暗光培养。菌丝生长观察方法同1.2.3.1。

1.3 数据处理

试验数据用统计软件SPSS Statistics 22.0 分析处理，并采用单因素方差分析多重比较，采用Duncan新复极差法检验各处理间的差异性。

2 结果与分析

2.1 鉴定结果

2.1.1 形态学鉴定

该野生菌株子实体（图1）中等，单生，扇形，菌盖米白色，宽8~12 cm，长5~7 cm，厚0.6~1.1 cm；菌肉白色，紧实；菌柄短、硬、粗，侧生，菌柄长3 cm、粗0.3~1.8 cm；菌盖边缘呈不规则波浪形。菌褶从菌柄部呈辐射状延生，白色，密度中等，不等长，在菌盖边缘处纵裂出许多小菌褶，无菌环、菌托。

图1 野生泡囊侧耳子实体和菌落形态

PDA 培养基上，菌落边缘整齐，菌丝洁白，粗壮，密度中等，菌丝中央形成分生孢子并冒黑色分泌物。这些特征符合《中国大型真菌》[17]中关于泡囊侧耳的描述，将该菌初步鉴定为泡囊侧耳，暂名为Pc-1。

2.1.2 ITS分析

rDNA ITS 基因测序结果：PCR 扩增产物长度为689 bp。测序结果在Genbank 核酸数据库中进行BLAST 搜索，与登录号 MW947482.1、MW947480.1菌株覆盖率高达100%，相似性达100%。得到序列相似性为96%~100%，全部为侧耳属的不同种。下载相似性最高的ITS 序列，以MH483677.1、JX193694.1 为外群，利用 MEGA X 软件采用 N-J 法构建系统发育树（图2）。从系统发育树可以看出，Pc-1与侧耳属的Pleurotus cystidiosus聚为一支，结合形态特征，可以判定Pc-1菌株为泡囊侧耳。

图2 Pc-1 ITS系统发育树

2.2 菌丝生物学特性

2.2.1 培养基碳源试验结果

由表1 可知，泡囊侧耳（Pc-1）菌丝在供试碳源培养基上均能萌发并生长。供试碳源培养基上菌丝生长速度、长势存在差异，其中含肌醇培养基上菌丝生长最快，平均长速为3.297 mm/d，但与山梨醇（3.221 mm/d）、甘露醇（3.197 mm/d）的平均长速差异不显著，之后依次是羧基纤维素钠（3.016 mm/d）、淀 粉（2.989 mm/d）、木 糖（2.912 mm/d）、蔗 糖（2.891 mm/d）、麦 芽 糖（2.863 mm/d）、果 糖（2.485 mm/d）、乳 糖（2.381 mm/d）、半 乳 糖（2.343 mm/d）、葡萄糖（2.312 mm/d）。其中葡萄糖、半乳糖、乳糖培养基间，麦芽糖、蔗糖、木糖培养基间菌丝生长速度无显著差异，其他之间均存在显著差异，部分存在极显著差异。菌丝密度和菌丝长势，甘露醇、淀粉、蔗糖、麦芽糖为碳源时菌丝浓密，长势旺盛，肌醇、山梨醇、羧基纤维素钠、木糖，果糖、葡萄糖次之，最差为含乳糖或半乳糖培养基。综合菌丝长势和生长速度，泡囊侧耳（Pc-1）菌丝生长最适碳源为甘露醇，其次为淀粉。

表1 供试碳源培养基上Pc-1菌株菌丝生长情况

2.2.2 培养基氮源试验结果

由表2 可知，泡囊侧耳（Pc-1）菌丝在供试氮源培养基上均能萌发并生长。供试氮源培养基上菌丝平均生长速度和长势存在差异，以酵母粉为氮源的培养基上菌丝生长速度最快，菌丝长速为2.523 mm/d，然后依次是胰蛋白胨（2.477 mm/d），大豆蛋白胨（2.452 mm/d），蛋白胨（2.221 mm/d），牛肉粉（2.111 mm/d），麦芽浸粉（1.997 mm/d），最慢为含甘氨酸培养基，只有1.698 mm/d。酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨培养基间菌丝生长速度无显著差异，与其他供试氮源培养基存在极显著差异；蛋白胨、牛肉粉、麦芽浸粉、甘氨酸培养基上菌丝生长速度差异极显著。菌丝密度和菌丝长势，酵母粉、胰蛋白胨为氮源时菌丝浓密，长势旺盛，牛肉粉、大豆蛋白胨次之，蛋白胨再次之，最差为甘氨酸、麦芽浸粉。综合菌丝长势和生长速度，酵母粉、胰蛋白胨为泡囊侧耳（Pc-1）菌丝生长的最适氮源。

表2 供试氮源培养基上Pc-1菌株菌丝生长情况

2.2.3 培养温度试验结果

由表3 可知，培养温度为15~33 ℃泡囊侧耳（Pc-1）菌丝均能生长，温度对泡囊侧耳（Pc-1）菌丝生长有显著影响，试验温度之间菌丝生长速度差异极显著。温度对菌丝生长速度的影响由大到小依次是 30 ℃、27 ℃、24 ℃、21 ℃、33 ℃、18 ℃、15 ℃、36 ℃。培养温度为30 ℃时菌丝生长最快，达4.061 mm/d。30 ℃、33 ℃时菌丝生长速度快速下降，36 ℃菌丝不萌发。温度低于18 ℃时，菌丝生长缓慢，菌丝稀疏。因此，泡囊侧耳（Pc-1）菌丝生长适宜温度为27~30 ℃，最适温度为30 ℃。

表3 试验温度条件下Pc-1菌株菌丝生长情况

2.2.4 培养基pH试验结果

由表4 可知，培养基初始pH 为5~10 时泡囊侧耳（Pc-1）菌丝均能生长，其在中性及弱碱性培养基上菌丝生长较好。当培养基pH为5时，菌丝生长最慢，长速为2.908 mm/d，长势较旺盛，菌丝较浓密。当培养基pH 为10 时，菌丝生长最快，长速为4.100 mm/d，长势旺盛，菌丝浓密。当培养基pH 为6~10 时，菌丝生长速度随着培养基pH 的上升而加快，菌丝长势也越来越旺盛，其中pH6、pH7 间菌丝长速无显著差异，但两者与其他处理差异达极显著。因此，泡囊侧耳（Pc-1）菌丝生长的适宜培养基pH为8~10，最适pH为10。

表4 不同pH的培养基上Pc-1菌株菌丝生长情况

3 小结与讨论

真菌传统的分类依据主要是考察形态结构，但形态特征易受到环境、基因和地域等因素影响，造成形态多样性，致使菌物鉴定存在偏差，不能做出准确的鉴定。与传统分类比较，分子生物学技术鉴定方法更加简便、准确可靠。内源转录间隔期（ITS）位于 rRNA 编码基因 18 S，5.8 S 和 28 S 之间的小基因片段，长度为600~800 bp，具有较高的保守性，表现为种类相对保守，种间差异较为明显[18]，已被广泛用于真菌鉴定和系统发育研究。试验综合子实体特征和ITS 序列分析，鉴定该野生菌株（PC-1）为侧耳属，泡囊侧耳。进一步对泡囊侧耳（Pc-1）生物学特性研究结果表明，Pc-1 菌丝培养阶段最适碳源为甘露醇，其次是淀粉，该结果与李蝶等[19]研究结果基本一致，与赵彦杰[20]和黄春燕等[21]结果存在差异；最适氮源是酵母粉、胰蛋白胨，该结果与目前有关囊泡恻然的报道基本相同。菌丝生长适宜温度为27~30 ℃，最适温度为30 ℃，温度高于36 ℃菌丝基本不萌发；菌丝在初始pH5~10 培养基上均可生长，喜好中性及偏碱性培养环境，最适pH 为10，这一结果与大部分泡囊侧耳菌株不一致。因此，泡囊侧耳不同菌株间的生物学特性存在一定的差异性。试验只是进行泡囊侧耳（Pc-1）生物学特性的初步研究，对各因素之间有无交互作用、出菇特性及生物活性等还需进一步研究。