银杏二萜内酯葡胺对轻型缺血性脑卒中/短暂性脑缺血发作的疗效及相关miRNA水平的影响

沈耀亮，范 佳，陈 波，何 晟，李 琪，胡晓峰，钱骅雯

0 引言

短暂性脑缺血发作(Transient ischemic attack,TIA)是一类由于颈动脉或椎-基底动脉系统发生短暂性供血不足，造成局灶性和短暂性脑缺血，导致的神经功能障碍性疾病[1]。TIA以往认为是缺血性脑卒中较为温和的表现形式，轻型缺血性脑卒中和TIA往往一线之隔，因此临床往往一起研究。流行病学研究证实，TIA患者1周内出现卒中风险为4%～10%，90 d卒中风险高达10%～20%[2-3]。针对轻型缺血性脑卒中/TIA患者，目前临床强调联合血小板抗凝治疗，以预防心脑血管事件。临床指南中对于轻型缺血性脑卒中/TIA的辅助治疗尚无明确指导意见。中医药在TIA防治方面效果显著，其中银杏二萜内酯葡胺是本课题组重点关注的中药活性成分。银杏是现存最古老的植物，中医认为其具有敛肺平喘、活血化瘀、通络止痛、化浊降脂的功效。现代药理学研究提示，银杏二萜内酯葡胺是银杏中最主要的活性成分之一，动物实验和临床试验均证实银杏二萜内酯葡胺具有明确的脑保护作用[4-6]。本研究纳入92例轻型缺血性脑卒中/TIA患者，选择3个轻型缺血性脑卒中/TIA相关miRNA微小RNA(miRNA)(miR-122-5p[7]、miR-146[8]和miR-23b-3p[9])作为切入点，探讨银杏二萜内酯葡胺的潜在TIA保护机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究连续性纳入2019年1月至2020年11月于常熟市第一人民医院本部的全科医学科、急诊内科以及下属常熟市辛庄中心卫生院住院治疗的轻型缺血性脑卒中/TIA患者共92例，包括轻型缺血性脑卒中患者86例和TIA患者6例。根据随机数字列表随机等分为对照组(46例)和试验组(46例)。纳入标准：①TIA诊断参考TIA中国专家共识(2011年更新版)[10]，包括由于局灶性脑和视网膜缺血所致的短暂发作的神经功能缺损发作，典型的临床症状持续时间在1 h之内，且不符合急性梗死的影像学诊断标准；②轻型缺血性脑卒中定义为,符合急性梗死的影像学诊断标准，NIHSS评分≤3分，其中意识评分为0分；③年龄18～80岁；④近1个月内未服用抗凝和抗血小板药物，未接受中药治疗；⑤完成脑血管CTA检测；⑥签署知情同意书。排除标准包括：①TIA最后一次发作距离入组首次静脉采血时间超过24 h；②活动性出血、出血倾向、严重肝肾功能不全、心力衰竭患者；③肿瘤患者；④孕产妇；⑤自身免疫性疾病患者；⑥其他颅脑或脑血管疾病史患者；⑦随访脱漏患者。本研究试验方案经我院伦理委员会审批通过(常一医伦202016)。

1.2 治疗方案 对照组患者予双抗(阿司匹林0.1 g口服，1次/d；氯吡格雷75 mg口服，1次/d)+他汀类药物(阿托伐他汀20 mg口服，1次/d)治疗，试验组在对照组治疗的基础上加用银杏二萜内酯葡胺注射液25 mg/次，以250 ml的0.9%氯化钠注射液稀释后，缓慢静脉滴注，1次/d；首次使用时控制滴速为10～15滴/min，若患者30 min内无明显不适，可逐渐提高滴速，疗程2周。所有患者出院后继续双抗治疗。

1.3 预后评价 本研究患者临床预后的评价包括早期评价和远期评价。对于TIA患者，若住院期间TIA未再发作或发作次数减少，持续时间短，发作症状减轻，则定义为早期神经功能改善。对于轻型缺血性脑卒中患者，将治疗1周神经功能完全恢复定义为早期神经功能改善。所有患者根据入组后3个月的随访结果，将发病后3个月改良的Rankin评分(mRS评分0～2分)的患者定义为远期预后良好。

1.4 血小板聚集率和血栓弹力图 本研究所有入组患者分别于入组时(T0)和入组后2周(T1)检测血小板聚集率和血栓弹力图(TEG)。所有检测均由我院检验科完成。血小板聚集率采用光比浊法分别检测 ADP 诱导和花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)诱导的血小板聚集率。TEG检测使用TEG分析仪(美国，Haemoscope公司)检测，记录反应时间R、凝血时间K、α角、最大振幅MA值、CI等参数，检测于采血后2 h内完成。

1.5 miRNA检测 所有入选患者分别在T0、T1 2个时间点，空腹抽取患者肘静脉血约15 ml，于4 ℃以3 000 r/min条件下离心30 min，提取上清液，置于-80 ℃冻存待检。通过Trizol法提取总RNA，再通过qRT-PCR方法合成cDNA。引物序列：miR-122-5p，F：5′-TAGCAAATATTGGAGCACGTCG-3′；R：5′- TGGAGTCGTGTCGTGC-3′。miR-146，F：5′-UAGUGGCUUCCUUUAUUAUUUGA-3′；R：5′-AGAUUUUUCGGUUGUAUCCUUAU-3′。miR-23b-3p，F：5′-UGGACCAGAGGUGACUGGUUGG-3′；R：5′-CCUCUCACUGCCAGGUCAAAUU-3′。已合成的cDNA通过7600型序列检测系统(ABI公司产品)建立反应体系，以U6作为内参，通过miR-leg7dgi混合物建立标准曲线[11]，计算血清miRNA的绝对含量。

2 结果

2.1 两组患者一般资料和预后结果比较 两组患者在平均年龄、性别分布、体重指数、慢性病(高血压病、糖尿病、冠心病)、血脂水平(低密度脂蛋白、三酰甘油、总胆固醇)、TIA患者比例、烟酒史和临床预后(早期神经功能改善和远期预后良好)方面差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者一般资料和预后结果比较[例(%)]

2.2 两组患者血小板聚集率和TEG结果比较 如表2所示，两组患者T0时血小板聚集率比较差异无统计学意义；治疗后，两组血小板聚集率均明显下降(P<0.05)，组间比较可见T1时试验组低于对照组(tADP诱导=2.360，P=0.020；tAA诱导=2.276，P=0.025)。两组患者T0时TEG比较差异无统计学意义，治疗后，各项TEG指标均明显改善(P<0.05)，组间比较可见，T1时试验组α角(t=2.486，P=0.014)和MA值(t=2.064，P=0.041)明显低于对照组。

表2 两组患者血小板聚集率和TEG结果比较

2.3 两组患者治疗前后miRNA水平比较 如表3所示，两组患者T0时3个miRNA水平比较差异均无统计学意义，治疗后两组miRNA水平明显下降(P<0.05)，组间比较可见，T1时试验组miR-122-5p和miR-146水平低于对照组(tmiR-122-5p=4.536，P<0.001；tmiR-146=2.445，P=0.016)。

表3 两组患者治疗前后miRNA水平比较

2.4 相关性分析 首先计算血小板抑制率、TEG指标和miRNA的波动幅度(△=T0-T1)，再通过Spearman相关性分析比较这些指标的波动幅度(△)与银杏二萜内酯葡胺治疗之间的相关性。可见相关系数波动于-0.501～0.067；通过偏相关分析校正年龄后，相关系数波动于-0.496～0.081；校正TIA之后，相关系数波动于-0.503～0.083。总体看来，银杏二萜内酯葡胺治疗与△miR-146相关性最大(r=-0.501，r校正年龄=-0.496，r校正TIA=-0.503，P<0.001)。见表4。

表4 相关性分析

3 讨论

轻型缺血性脑卒中与TIA的关系类似于心绞痛与心肌梗死之间，TIA患者卒中风险明显升高。针对轻型缺血性脑卒中/TIA患者，目前缺乏辅助治疗方面的临床研究。本研究选择中药银杏提取物银杏二萜内酯葡胺，针对92例轻型缺血性脑卒中/TIA患者进行干预治疗，比较血小板聚集率、TEG水平改变，并以3种轻型缺血性脑卒中/TIA相关miRNA为切入点，比较前后治疗的波动情况。

本研究中，两组患者均予以双抗+他汀等卒中常规治疗。治疗2周后，两组患者血小板聚集率明显下降，提示抗血小板有效；试验组患者血小板聚集率明显低于对照组，表明加用银杏二萜内酯葡胺有助于提高双抗药物的疗效，更有利于抗血小板聚集水平的达标。血小板聚集是动脉血栓形成的核心环节，因此抗血小板聚集是卒中等缺血性心脑血管疾病的首要预防和治疗手段[12]。石红婷等[13]针对197例脑梗死患者临床资料进行分析，比较阿司匹林和氯吡格雷抵抗的发生率，结果表明，银杏二萜内酯葡胺影响脑梗死患者的血小板聚集率，可降低抗血小板聚集药物抵抗的发生率。本研究结果与之相符，但本研究纳入患者为轻型缺血性脑卒中/TIA患者，进一步丰富了银杏二萜内酯葡胺辅助抗血小板治疗的试验依据。

TEG作为临床常用的凝血功能评价指标，可以动态反映血液从凝血启动到纤溶的过程，其中K值、α角和MA是反映血小板功能的指标[14-16]。本研究中，两组患者治疗2周后K值、α角和MA显著下降，提示抗血小板有效；试验组患者k值、α角和MA明显低于对照组，进一步显示银杏二萜内酯葡胺有助于辅助双抗药物的疗效，更有利于抗血小板聚集水平的达标。目前，在TEG检测的相关临床报道中，已证实银杏叶片[17]和银杏酮酯[18]可以改善TEG指标，具有改善抗血小板药物抵抗的作用。但缺乏银杏二萜内酯葡胺的相关TEG检测改善情况，本研究是对银杏活血效果方面的进一步补充。

miRNA为非编码RNA，广泛参与人体一系列生理和病理生理过程。本研究选择3种miRNA，分别是miR-122-5p、miR-146和miR-23b-3p。本研究显示，治疗2周后，两组患者miRNA水平明显下降，且试验组患者miR-122-5p和miR-146明显低于对照组，△miR-146与银杏二萜内酯葡胺的相关性最大，提示miR-146可能是关键miRNA。李琳琳等[7]综合分析150例TIA患者，结果表明，血清miR-122-5p水平增高是TIA患者发生脑梗死和死亡等终点事件的独立危险因素。韩冬林等[8]研究提示，血清miR-146a水平有助于预测TIA患者短期CI的发生风险。樊春荔等[9]研究提示，脑梗死和TIA患者血清miR-23b-3p水平均显著增高，可用于评估判断病情。本研究结果与上述研究相符，并进一步提示银杏二萜内酯葡胺对于miR-122-5p和miR-146的影响，尤其是后者。尚有待进一步的动物和细胞研究论证银杏二萜内酯葡胺的具体机制。

综上所述，银杏二萜内酯葡胺辅助治疗可改善轻型缺血性脑卒中/TIA患者的血小板聚集率和TEG水平，降低相关miRNA水平，尤其是miR-146。