替格瑞洛对家兔血小板功能及手术出血量的影响

刘炎东，李君晴，曾祥刚*

0 引言

替格瑞洛是一种P2Y12受体抑制剂，是最新指南推荐用于治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的一种新型且有效的抗血小板药物[1]。既往研究显示，接受冠脉支架植入治疗冠心病的患者在2年内行非心脏手术的几率约为20%[2]，这些患者往往需要双联抗血小板治疗(通常是阿司匹林联合一种P2Y12受体抑制剂),以降低支架内血栓形成的风险[3]。然而,近期TWILIGHT和TICO 2项大型研究结果证实，患者在接受3个月双联抗血小板治疗后，使用替格瑞洛单药治疗的效果和安全性优于12个月的双抗标准疗法[4-5]，可能预示着未来麻醉医生将遇到更多正在接受替格瑞洛单药治疗的患者需要行急诊手术或择期手术的情况，这些患者在术前过早或过晚停止抗血小板治疗将可能面临围术期严重的心脏缺血风险或手术出血风险。Malm等[6]证明，接受替格瑞洛治疗的患者在心脏手术术前行血小板功能测试，有助于预测围术期发生严重出血的风险，而对于非心脏手术(如神经外科、泌尿外科手术)，基于血小板功能测试来确定P2Y12受体抑制剂停用时间尚有争议。本研究将分析替格瑞洛单药应用对家兔血小板功能及手术出血量的影响及术前血小板功能与家兔手术出血量的相关性，探讨血小板功能检测对预测手术出血风险并指导围术期替格瑞洛应用的临床价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康成年新西兰家兔30只，体重2.0～2.5 kg，2～4月龄，雌雄不限，混合饲料，分笼喂养。本实验经贵州医科大学动物伦理委员会审查批准实施(2101151)，实验动物由贵州医科大学实验动物中心提供[动物使用许可证号：SYXK(黔)2018-0001]。家兔适应性喂养1周后开始实验，按照随机数字表法分为生理盐水组(A组)、停药组(B组)、不停药组(C组)，每组10只。

1.2 药品、试剂及仪器 替格瑞洛片(倍林达，90 mg×14片/盒，批号：J20171077，AstraZeneca AB公司)，戊巴比妥钠(5 g/瓶，批号：922L035，北京索莱宝)，5%复方利多卡因乳膏(批号：10 g/支，批号：H20063466，清华同方)，二磷酸腺苷二钠(ADP Na2，CAS:16178-48-6，北京索莱宝)，3 ml枸橼酸钠1∶9抗凝管(批号：0065398，美国碧迪公司)，3 ml EDTA-K2抗凝管(批号：0358744，美国碧迪公司)，Sonoclot®凝血和血小板功能分析仪(美国Sienco)，CHRONO-LOG 700血小板聚集仪(美国Chrono-log)，Mindray BC-5150 全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞)。

1.3 给药方法 指南推荐成人首次给予替格瑞洛负荷剂量 180 mg，维持剂量为90 mg/次，每天2次[7]。因此，可根据家兔与人之间药物等效剂量换算公式[8]计算出家兔的用药量。三组家兔均采用灌胃法给药，生理盐水对照第1天给予5 ml生理盐水灌胃1次，从第2天开始改为2次/d，连续灌胃6 d。停药组第1天给予9.0 mg/kg替格瑞洛配置成的5 ml药液灌胃1次，从第2天开始给予4.5 mg/kg替格瑞洛配置成的5 ml药液灌胃，2次/d，连续灌胃3 d后改用生理盐水5 ml灌胃3 d。停药组第1天给予9.0 mg/kg替格瑞洛配置成的5 ml药液灌胃1次，从第2天开始给予4.5 mg/kg替格瑞洛所配置成的5 ml药液灌胃，2次/d，连续灌胃6 d。

1.4 检测指标 分别于给药前、给药第4天及第7天经家兔耳中动脉采血3次，每次5 ml，其中2.7 ml用于检测血小板最大聚集率(Maximum platelet aggregation rate，MPAR)，0.5 ml用于Sonoclot®检测血小板功能(Platelet function，PF)，1.8 ml用于血小板计数测定。于给药第7天时，对家兔进行肾脏皮质切开手术，并记录家兔的出血时间及手术出血量。

1.4.1 血小板最大聚集率检测 家兔耳中动脉血液2.7 ml加入3 ml枸橼酸钠1∶9抗凝采血管中，混匀后立即以800 r/min离心8 min取上清液制备富血小板血浆，剩余部分3 000 r/min 离心10 min后制备贫血小板血浆作调零备用。在双通道Chrono-Log血小板聚集仪上通过光比浊法(ADP终浓度为5 μmol/L)测定曲线最高处的血小板聚集率(MPAR)。

1.4.2 血小板功能检测 严格按照Sonoclot®凝血及血小板功能分析仪使用说明将配套试杯及探针安装至仪器上，室温下向试杯中加入即时采集的兔血样本360 μl，待仪器振荡混匀后关闭仪器盖子，开始自动检测。当试杯中凝血发生时血液黏滞度发生变化，分析仪通过传感器感受凝血对振荡探针低频振荡波的机械阻抗变化并转化为电信号，最后经电脑处理计算出PF值。

1.4.3 血小板计数测定 室温下将1.8 ml兔血缓慢加入EDTA-K2抗凝管中，轻轻混匀，通过Mindray全自动血液细胞分析仪进行计数。

1.4.4 出血时间测定 在家兔灌胃第7天时，室温下将家兔右侧耳缘充分脱毛处理，予利多卡因乳膏充分表面麻醉后进行消毒，用无菌手术剪在家兔右侧耳缘做一个长约0.5 cm的创口，创口均于耳缘中部垂直于耳缘剪开，使血液自然流出。创口开始流出血液时立即使用秒表计时，随后每隔5 s用滤纸条轻触血液，避免直接触及或按压切口，蘸取流出的血液，滤纸条上的血迹按时间顺序排列，直至滤纸条上无新鲜血迹，计时结束。此时秒表上计时数即为出血时间。

1.4.5 手术出血量测定 家兔灌胃第7天时，由同一人员对家兔进行肾脏皮质切开手术。使用3%的戊巴比妥钠以1.5 ml/kg从家兔耳缘静脉注射进行麻醉，麻醉后修剪兔毛备皮，常规消毒铺巾后，以左侧肋脊角为标志做左背部斜切口，从后腹膜逐层切开，充分暴露肾脏，用手术刀在肾脏外侧缘皮质正中划一条长约1.5 cm、深约0.3 cm的伤口，避免划伤肾髓质，在伤口中部缝合3针，待肾脏伤口无明显血液渗出后逐层关腹。使用去皮称重的无菌干棉球收集术中出血，电子天秤称重后记录出血量。

2 结果

2.1 各组家兔服药前后血小板计数比较 结果显示，服药前后各组家兔血小板计数比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组家兔服药前后血小板计数比较(×109/L)

2.2 各组家兔服药前后MPAR比较 服药前各组MPAR差异无统计学意义 (P>0.05)。第4天，停药组和不停药组的MPAR较生理盐水对照组及服药前明显降低(P<0.05)；第7天，停药组的MPAR与生理盐水对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05)，不停药组MPAR较生理盐水对照组及服药前明显降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组家兔服药前后MPAR比较(%)

2.3 各组家兔服药前后PF值比较 结果显示，服药前后各组家兔PF值差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组家兔服药前后PF值比较

2.4 各组家兔第7天时手术出血量及出血时间比较 结果显示，第7天时，停药组与生理盐水对照组比较，手术出血量及出血时间差异均无统计学意义(P>0.05)。不停药组手术出血量与其余两组比较均明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)。不停药组出血时间与其余两组比较均明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组第7天手术出血量及出血时间比较注：#与生理盐水对照组比较，P<0.05；*与停药组比较，P<0.05

2.5 家兔最大血小板聚集率与手术出血量的相关性 Spearman相关性分析结果显示，MPAR和手术出血量之间呈现明显负相关(r=-0.623，P<0.05)，即MPAR越低，出血量越多。

3 讨论

替格瑞洛是一种环戊三唑嘧啶类抗血小板聚集药物，它是一种非前体药物，不经肝脏代谢即可与P2Y12受体可逆性结合，从而阻断ADP途径抑制的血小板聚集[9]。研究已经证实，在我国人群中，携带CYP2C19功能缺失等位基因与较高的氯吡格雷耐药性之间存在相关性[10]，而服用替格瑞洛相较氯吡格雷可以降低携带此类无效等位基因的患者发生缺血事件的风险[11]。因此，国内外冠心病相关指南均推荐替格瑞洛为一线治疗药物。欧洲最新指南更是指出，除外无法获取替格瑞洛或存在使用禁忌证的情况，其余情况均应优先使用替格瑞洛[12]。替格瑞洛给药后血浆浓度在1.5～3 h内达到峰值，2～3 d后达到稳定状态[13]，停药后作用消失时间为3～5 d[14]。尽管欧洲指南及国内指南都认为行非心脏手术的患者术前3 d停用替格瑞洛即可[1,15]，但这种“一刀切”的停药方案并未考虑到个体间停用抗血小板药物后血小板恢复时间的差异，并且“东亚悖论”认为，与西方患者相比，亚洲患者抗血小板治疗后出血风险更高[16]，因此，对于亚洲患者，确定术前停止抗血小板治疗的时间应采取个体化治疗方式。研究显示，按替格瑞洛指南推荐，术前3 d停药后，约25%患者停药3 d时血小板功能恢复不完全，可能存在手术出血风险，或许血小板功能检测是用于确定手术时机的一个有价值的工具[17]。目前指南仅建议在心脏手术前使用血小板功能检测方法帮助近期使用过P2Y12受体抑制剂的患者确定手术时机[15]，然而在非心脏手术中相关支持证据较少。

本研究结果显示，服药前后各组家兔的血小板数目并未发生显著改变，表明替格瑞洛并不是通过影响血小板的数量而发挥抗血小板作用。在各组血小板计数无明显差异的情况下，服用替格瑞洛至药物作用达到稳态后，家兔由ADP诱导的MPAR显著下降，这主要是由于替格瑞洛通过与血小板P2Y12受体非竞争性结合，阻断了通过ADP途径介导的血小板聚集。在第7天时，不停药组出血时间显著延长，手术出血量显著增多，这主要是由于该组家兔血小板聚集功能受到持续抑制作用，影响了生理性止血过程；而停药组停用替格瑞洛3 d后，由于替格瑞洛与血小板可逆性结合的特性，体内替格瑞洛经代谢排出后血小板恢复正常功能，MPAR恢复至正常水平，出血时间和手术出血量与对照组无明显差异。本研究结果显示，术前经光比浊法测定的血小板最大聚集率与手术中出血量存在相关性。Mahla等[18]在评估术前7 d内应用氯吡格雷患者的血小板反应性与非心脏手术出血量相关性的研究中也得出了相似的结论。对于急诊手术而言，术前要做到停用抗血小板药物达到指南推荐时间较为困难，本研究结果表明，在术前行MPAR检测将有助于术者预料手术出血风险，从而提前做出应对措施。然而，血小板的功能包括黏附、活化、聚集、释放及血块收缩等，仅依靠血小板聚集能力代表血小板功能较为片面，并且现有的检测方法均为体外检测，无法完全模拟体内复杂的生理止血过程。故仅以血小板聚集能力单一指标预测外科手术出血量并指导术前替格瑞洛停药时间还需大量研究予以验证。此外，本研究还发现三组家兔在所有时间点上由Sonoclot®分析仪检测出的PF值差异均无统计学意义，其结果无法反映服用替格瑞洛后所抑制的血小板功能及停药后血小板功能的恢复。原因可能是其试剂杯中的玻璃珠经内源性凝血途径快速激活凝血酶原，其作用掩盖了替格瑞洛经ADP途径所致的血小板抑制作用，故本研究未能得出PF值与手术出血量存在相关性的结论。

本研究为动物模拟临床实验，实验结果仍需在临床上进一步验证后方可推广。同时，本实验仅验证了MPAR与手术出血量的相关性，未能提供家兔手术安全的MPAR治疗窗，相关结论尚需进一步研究。另一方面，光比浊法仅反映了血小板的聚集功能，有关血小板其他功能对手术出血量的影响仍是本课题组今后继续研究的方向。

综上所述，术前3 d停用替格瑞洛可使家兔血小板功能及出血时间恢复至正常水平且不增加手术出血量；由于MPAR与手术出血量之间存在良好的相关性，故在服用替格瑞洛的情况下行术前MPRA的测定对评估手术出血风险有一定的帮助，但根据MPAR制定替格瑞洛术前停用时间仍需更多研究资料的支持。