斜带石斑鱼mstn对其肌肉细胞增殖分化及相关基因表达的影响*

杨炎，夏俊，王庆，何颖琳，张勇，赵会宏，杨慧荣，4

1. 华南农业大学海洋学院/海洋生物资源保护与利用粤港联合实验室，广东广州510642

2. 新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，新疆乌鲁木齐830000

3. 中山大学水生经济动物研究所/广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州510275

4. 华南农业大学中山创新中心，广东中山528400

肌肉生长抑制素（mstn，myostatin）又称生长分化因子8（gdf-8），抑制肌肉细胞的增殖与分化，是骨骼肌的生长的负调控因子［1-4］。研究表明，mstn在鱼类中的表达与在哺乳动物中主在骨骼肌中的表达不同，目前已经在鱼类的多种组织中检测到了mstn的表达［5-8］，这表明mstn在鱼类中可能存在多种功能。

生肌过程是一个复杂的过程，在此过程中，mstn与包括和生肌决定因子-5（myf5，myogenic factor 5）、肌分化决定因子（myod，myogenic differentiation）、肌肉生成素（myog，myogenin）、成肌调节因子（mrf4，myogenic regulatory factor 4）在内的肌源性调节因子（mrfs，myogenic regulatore factors）在调节肌源性细胞的增殖和分化方面存在相互关系［4，9-10］，而依赖性激酶抑制因子（p21）与细胞增殖有关［11-12］。目前，人们认为Smads 是介导mstn信号的介质，Smads蛋白可以协助mstn对肌肉细胞的增殖与分化进行调控［13-15］。一方面，mstn通过调节p21的表达来调控细胞增殖［16-18］，另一方面，mstn可以通过调控mrfs的表达进而调控细胞的分化［19-21］。

在以往关于mstn的研究中，研究对象多集中于猪、牛、羊等哺乳动物，针对鱼类的相关研究较少。斜带石斑鱼Epinephelus coioides，属于硬骨鱼纲Osteichthyes、鲈形目Perciformes、鮨科Serranidae、石斑鱼亚科Epinephelinate。由于石斑鱼肉质肥美鲜嫩、高蛋白、营养价值较高，是我国南方和东南亚国家和地区大力发展的经济鱼类。因此，本研究以斜带石斑鱼为研究对象。通过石斑鱼的GS 细胞系和肌肉原代细胞对mstn的功能进行初步探究，揭示了Mstn 的亚细胞定位、Mstn 重组蛋白对mstn信号通路下游及相关基因的影响，初步推测Mstn 在斜带石斑鱼肌肉细胞增殖分化中的生理功能。

1 材料与方法

1.1 材料

斜带石斑鱼体质量（31.6±6.7）g，体长（12.8±1.0）cm，购自广东省海洋渔业试验中心；取样时，首先用丁香酚将实验鱼麻醉，然后用φ=75%的乙醇擦拭鱼体表，迅速将部分肌肉组织取下，一部分保存至含有Sample Protector for RNA/DNA（TAKARA，Japan）的1.5 mL 中；另一部分保存至含有φ=10%双抗（青霉素、链霉素）的L15 培养液。取样过程所用剪刀、镊子、刀片等用φ=75%的乙醇擦拭后全部高压灭菌，所有的实验用具紫外灭菌30 min。取样过程于超净台中进行，所有实验动物操作均在华南农业大学实验动物伦理委员会的相关指导下进行。Mstn 重组蛋白交由金斯瑞生物科技有限公司合成，其生物活性经肌肉原代细胞和Thermo Varioskan LUX 多功能酶标仪测试。

1.2 肌肉原代细胞的培养

将取样的肌肉组织块用含有φ=10%双抗的L15培养液清洗3 次，然后剪成1 mm×1 mm×1 mm 左右的小块放入培养瓶内。将培养瓶翻转，放入28 ℃细胞培养箱7～8 h。向组织块上滴加含有φ=4%双抗以及φ=20%胎牛血清（FBS）（Gibco，USA）的L15培养液后正面放入细胞培养箱培养，待细胞从组织块爬出，补加培养液至5 mL。细胞爬满培养瓶后，用胰酶（Gibco，USA）将细胞消化成细胞悬液，去掉组织块后离心弃上清，用2.5 mL 原来的培养液将剩余细胞吹打均匀，转至培养瓶中，补充含φ=1%双抗和φ=20% FBS 的L15 培养液至5 mL。定期在显微镜下观察细胞生长情况，待培养瓶中细胞铺满一层后用胰酶消化，用含φ=1%双抗和φ=10%～20%血清的培养液进行半换液培养。

1.3 肌肉原代细胞的增殖

1.3.1 CCK-8 检测细胞增殖在5 个96 孔板中（100 μL/孔）接种细胞悬液，每孔约2 000 个细胞，24 h后用1 000 nmol/L Mstn处理，对照组用相同体积的PBS 处理，空白组不做处理，每组8 个重复。每天同一时间取出96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱中孵育4 h。用酶标仪测定450 nm 处的吸光度，连续5 d，然后绘制细胞生长曲线。

1.3.2 流式细胞仪检测细胞周期在6 孔板（1.6 mL/孔）接种细胞悬液，24 h后用1 000 nmol/L Mstn蛋白处理，对照组用相同体积的PBS处理，每组3 个重复。24 h 后用无EDTA 的胰酶消化细胞，800g离心5 min，去上清。用4 ℃的PBS清洗细胞2次，后加入250 μL PBS 重悬细胞，然后加入750 μL 4 ℃无水乙醇，4 ℃固定过夜。样品离心去上清，用4℃PBS清洗1次，再次离心去上清。加入Rnase A 溶液20 μL，37 ℃水浴30 min。加入PI 染色液至体积分数为50 μL/mL，缓慢并充分混匀后4 ℃避光孵育30 min，染色完成后在24 h内完成流式检测。

1.4 重组质粒的构建与细胞转染

为了构建mstn的表达载体，分别用含有限制性酶切位点KpnI和Bamh I的引物扩增。目的基因被插入到pEGFP-C1 载体中。引物序列见表1。得到的重组质粒通过DNA 测序确认。Ezgene Endo-Free Plasmid Kit（BioMIGA，USA）用于获得无内毒素质粒。Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）用于质粒转染GS细胞。使用详见相关试剂盒说明书。

1.5 实时荧光定量PCR技术

分别用10、100 和1 000 nmol/L 的Mstn 处理原代细胞。以PBS 处理作为对照，每组4 个重复。24 h 后用胰酶消化收集细胞，提取RNA 后利用ReverTra Ace®qPCR RT Kit（TOYOBO，Japan）反转录。以β-actin基因为内参，利用SYBR®Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO，Japan）进行实时荧光定量，测定p21、smad3、mrf4、myod和myog的表达情况。引物序列见表1。使用详见相关试剂盒说明书。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.6 数据处理

利用Graphpad Prism 8.0 软件对实验数据进行统计分析，以β-actin基因为内参，用2-△△Ct法进行分析。数据以平均值±标准差（means±SD）。当P＜0.05时，认为具有显著性差异。

2 结 果

2.1 斜带石斑鱼Mstn亚细胞定位分析

为了检测Mstn 在细胞中的定位，将pEGFPMSTN 质粒转染至GS 细胞中，转染pEGFP-C1 质粒至GS 细胞作为对照。利用荧光显微镜进行观察，发现pEGFP-MSTN 过表达细胞的细胞质中都观察到了呈点状分布的绿色荧光（图1）。这表明Mstn在GS细胞中呈细胞质分布，Mstn蛋白在细胞质中表达。

图1 Mstn亚细胞定位Fig.1 Subcellular localization of Mstn

2.2 Mstn重组蛋白对肌肉原代细胞增殖的影响

为了检测mstn对肌肉细胞增殖的影响，本研究用Mstn 重组蛋白分别刺激肌肉原代细胞1、2、3、4 和5 d，通过用酶标仪测定肌肉原代细胞每天的A值，再绘制细胞生长曲线。研究发现，用Mstn 重组蛋白处理的实验组细胞生长明显减缓，第1天时，对照组和实验组细胞的活性差异就达到了显著性水平，并且随着处理时间的增加，细胞活性差异进一步扩大（图2a）。同时，在用Mstn重组蛋白刺激肌肉原代细胞24 h后，收集6孔板中的细胞制作细胞悬液，固定后染色，用流式细胞仪对处理后的样品进行检测。结果表明，与对照组相比（图2b），Mstn 重组蛋白处理后的细胞在S 期受阻，细胞周期受阻（图2c）。

图2 Mstn重组蛋白对肌肉原代细胞增殖的影响Fig.2 Effect of Mstn recombinant protein on proliferation of muscle primary cells

2.3 Mstn重组蛋白对mstn信号通路下游及相关基因的影响

为了检测mstn对肌肉原代细胞分化的影响，本研究设计了斜带石斑鱼myod、myog、smad3、mrf4、p21等增殖分化相关的定量引物，在用不同浓度的Mstn 重组蛋白处理后，通过RT-qPCR 来测定这些基因的表达。结果如图3所示，与对照组相比，p21mRNA 的表达随着处理浓度的升高而上升，当处理浓度为100 和1 000 nmol/L 时存在显著性差异；smad3mRNA 和mrf4mRNA 的表达均随着处理浓度的升高而上升，但趋势并不明显，始终不存在显著性差异；myodmRNA和myogmRNA的表达均随着处理浓度的升高而下降，但myodmRNA 下降趋势并不显著，myogmRNA 则有着明显的下降，在处理浓度为100 和1 000 nmol/L 时存在显著性差异。

图3 不同浓度Mstn重组蛋白处理对mstn信号通路下游及相关基因的影响Fig.3 Effects of different concentrations of Mstn recombinant protein treatment on downstream mstn signaling pathway and related genes

3 讨 论

在肌肉细胞中，mstn被认为是抑制肌肉生长的强负调节因子［2，13，22-23］。研究证明，mstn的负调节作用主要是抑制细胞尤其是抑制肌肉细胞的增殖和分化［16，24-27］。

在本次研究中，亚细胞定位分析结果表明，绿色荧光在细胞质中呈点状分布，表明Mstn 蛋白在细胞质中表达。在山羊中，亚细胞定位预测Mstn 定位于高尔基体、质膜和内质网膜［28］，证明Mstn定位于细胞质的结果是可靠的。

通过对mstn信号通路下游及相关基因进行RTqPCR 检测，结果表明实验组p21、smad3和mrf4的表达量均高于对照组，而实验组myod和myog的表达量均低于对照组。经过统计学分析，其中p21的表达量在Mstn 处理浓度为中浓度和高浓度时与对照组相比具有显著性差异，而smad3和mrf4虽然具有升高的趋势，但与对照组相比不具有显著性差异，表达量下降的myod和myog与对照组相比也不具有显著性差异。许多研究表明，Mstn 结合跨膜受体结合来触发信号传导［13-14，19，29］。在受体下游，Smads被证明是mstn信号的典型介体［13-15，30-31］，因此认为mstn是通过经典的Smads 信号通路起作用。Smad3转导TGF-β的信号，属于受体激活的Smads。本研究中，用Mstn 刺激肌肉原代细胞之后，我们检测到smad3mRNA 的表达升高，进一步证明mstn对smad3具有调节作用。Mrfs家族相关基因是肌源性调节因子，它们对肌肉细胞增殖与分化具有重要影响，在不同的发育时期按照一定的顺序进行表达，对肌肉细胞的分化进行调节［32-33］。本研究中，在Mstn 刺激后，mrf4的表达有了一定程度的上升，myod和myog表达量有一定程度的下降。已有研究证明，mstn信号传导诱导Smad3 磷酸化并增加Smad3 与Myod 的相互作用，同时，mstn通过作用于Smads 复合物导致mrfs 家族成员如myog和myod的表达量下降［19］；抑制小鼠中的mstn，发现mrf4表达下降［34］。因此，推测在用Mstn 刺激后，细胞内smad3表达量上升，信号转导加强，作用于smad3下游影响细胞分化的mrfs家族，导致myod、myog表达量下降和mrf4表达量的上升，来促进肌肉原代细胞的分化。

另外，用Mstn 刺激后，细胞内的p21表达量上升。研究表明，p21是细胞增殖的抑制基因［35-37］。Mstn 可 以 抑 制 成 肌 细 胞 的 增 殖［9，38-41］。Mstn 通过上调p21的表达来抑制肌肉细胞的增殖［9］。本研究中用Mstn处理肌肉原代细胞后检测，发现p21表达呈现上升趋势的结果与已有研究相符。为了进一步验证mstn对肌肉细胞增殖的影响，通过用Mstn 处理肌肉原代细胞，在酶标仪上检测在不同处理时间的吸光度并绘制细胞生长曲线图，并通过流式细胞仪检测细胞周期。根据生长曲线可以看出，在用Mstn刺激后，细胞的增殖被抑制，这与此前研究中mstn抑制肌肉细胞增殖的结果相符［9，38-41］。而流式细胞仪检测结果也证明，被Mstn重组蛋白处理过后，细胞停滞在S 期，G2 期细胞比例减少，细胞周期受阻。因此，推测本研究中Mstn 上调细胞中p21的表达，导致细胞周期受阻，进而导致细胞增殖受阻，证明Mstn 抑制肌肉原代细胞的增殖。

本研究以斜带石斑鱼的GS 细胞和肌肉原代细胞为研究对象，揭示了Mstn 的亚细胞定位、Mstn重组蛋白对mstn信号通路下游及相关基因及对肌肉细胞增殖的影响。证明了Mstn 在斜带石斑鱼GS细胞中呈点状分布；Mstn 重组蛋白上调smad3、mrf4的表达，下调myod、myog的表达，来调节细胞的分化；同时Mstn 重组蛋白能上调p21的表达，抑制细胞的增殖。验证了Mstn 在肌肉发育过程中的生物学功能，为后续深入开展Mstn 对鱼类肌肉发育的影响研究奠定了理论基础。