大蒜中黄酮类化合物的提取及抗疲劳活性研究

党剑,赵民

(新乡医学院,河南 新乡 453003)

大蒜属于百合科葱属植物的地下鳞茎，是一种常用的调味品。我国从汉代开始引进大蒜种植，之后扩散到全国各地。目前，我国是大蒜的主要生产国，大蒜年产量约为400万吨。

大蒜中富含微量元素，包括镁、钒、铁、钙、铝、铜等，其中，大蒜中含量最高的元素是磷，其次是铁、镁、锌和铝，此外，大蒜中也含有丰富的化学成分，包括蛋白质、氨基酸、维生素B和维生素C，具有多种生物功效。自古以来，大蒜的药用价值都被人们熟知和利用，《本草纲目》中记载了大蒜的通窍、驱寒、助消化等多种生物功效，近代科学研究结果也表明，大蒜具有抗菌、防治心血管疾病、抑制肿瘤、改善肝脏机能等多种生物功效。

黄酮是从天然植物中分离提纯所获得的化合物，是一种植物的次级代谢产物，主要存在于植物的花、根、茎、叶中。黄酮类化合物在治疗人类疾病方面表现突出，已经被用于治疗人类心血管疾病、抗氧化、抗菌、抗炎和降血脂。随着抗癌药物的研究，人们对战胜癌症的信心也越来越足，现代科学家们正向天然抗癌药物的方向前进，黄酮类化合物能够抑制癌细胞扩散和生长，有望成为人类抗癌药物的突破口。黄酮类化合物也具有杀菌作用，通过破坏微生物细胞膜的完整性，黄酮类化合物可以影响微生物内的电子传递和营养吸收，从根本上抑制微生物的生长。

黄酮类化合物一般难溶于水，易溶于乙醇，这与黄酮类化合物的结构存在着密切的关系。常用的黄酮提纯方法有热水浸提法、有机溶剂提取法、超声波辅助提取法和微波辅助提取法。黄酮类化合物提纯在多种植物中已有研究报道，但是大蒜中黄酮的提纯研究报道相对较少。本研究基于此，通过有机溶剂提取法、单因素试验法和正交试验法对大蒜中黄酮的提取工艺进行优化，并对大蒜的抗疲劳活性进行比较。

1 试验材料与设备

新鲜白皮大蒜：购于当地超市，去皮后，于40 ℃的恒温箱中烘干，粉碎，过80目筛，冷藏保存。

芦丁标准品；无水乙醇。

设备：烘箱；粉碎机；药物天平；分析天平；恒温水浴锅；超声清洗器；离心机；紫外分光光度计。

2 试验方法

2.1 大蒜黄酮提取量测定

称取一定量的样品置于离心管中，使用离心机在3000 r/min的转速下进行离心，测定其吸光值A，通过紫外分光光度计测定大蒜中黄酮的提取量，根据标准曲线的方程计算出黄酮的质量浓度C，按照下式计算黄酮的提取量：

Y(大蒜黄酮提取量，mg/g)=[黄酮质量浓度(mg/mL)×总体积(mL)×稀释倍数]/大蒜粉末质量(g)。

2.2 单因素试验

2.2.1 液料比对大蒜黄酮提取量的影响

称取大蒜样品0.20 g，在水浴温度50 ℃、水浴时间3.5 h和乙醇浓度60%的条件下，研究液料比(60∶1、65∶1、70∶1、75∶1、80∶1)对大蒜中黄酮提取量的影响。

2.2.2 水浴时间对大蒜黄酮提取量的影响

称取大蒜样品0.20 g，在水浴温度50 ℃、液料比70∶1和乙醇浓度60%的条件下，研究水浴时间(2，2.5，3，3.5，4，4.5，5 h)对大蒜中黄酮提取量的影响。

2.2.3 水浴温度对大蒜黄酮提取量的影响

称取大蒜样品0.20 g，在液料比70∶1、水浴时间3.5 h和乙醇浓度60%的条件下，研究水浴温度(30，40，50，60，70 ℃)对大蒜中黄酮提取量的影响。

2.2.4 乙醇浓度对大蒜黄酮提取量的影响

称取大蒜样品0.20 g，在水浴温度50 ℃、水浴时间3.5 h和液料比70∶1的条件下，研究乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%)对大蒜中黄酮提取量的影响。

2.3 正交试验

结合单因素试验结果，根据Box-Behnken的设计原理，以液料比、乙醇浓度、水浴时间和水浴温度为变量因子，以大蒜中黄酮提取量作为指标，进行四因素三水平分析(见表1)，对大蒜中黄酮的提取条件进行优化。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

3 试验结果与分析

3.1 大蒜中黄酮类化合物提取工艺

3.1.1 液料比对大蒜中黄酮提取量的影响

由图1可知，大蒜中黄酮提取量直接受到液料比的影响，液料比过大或者过小都会影响大蒜中黄酮的提取量。当液料比为70∶1时，大蒜中黄酮的提取量最大，为0.81 mg/g。当液料比小于70∶1时，大蒜中黄酮的提取量随着液料比的增大而增加，这是由于液料比增加，大蒜与乙醇的接触面积增大，黄酮的提取量也随之增加。当液料比大于70∶1时，大蒜中黄酮提取量随之减小，这是由于提取液体积增大，大蒜的浓度降低，大蒜中的其他物质进入了料液中，从而导致黄酮的提取量减小。所以，最适的液料比为70∶1。

图1 液料比对大蒜中黄酮提取量的影响

3.1.2 水浴时间对大蒜中黄酮提取量的影响

由图2可知，当水浴时间小于3.5 h时，大蒜中黄酮的提取量随着时间的增长而增加，当水浴时间达到3.5 h时，大蒜中黄酮的提取量为0.8 mg/g。当水浴时间大于3.5 h时，大蒜中黄酮的提取量随着提取时间的增长而逐渐减小，这是由于当水浴时间过短时，大蒜中的黄酮成分不能充分溶解于溶液中，随着提取时间的延长，大蒜中除了黄酮以外的其他成分进入溶液中，造成大蒜中的黄酮溶解量减小，此外，黄酮成分不稳定，受温度影响较为明显，长时间水浴导致黄酮成分分解。所以，最适的大蒜水浴时间为3.5 h。

图2 水浴时间对大蒜中黄酮提取量的影响Fig.2 The effect of water bath time on the extraction amount of flavonoids from garlic

3.1.3 水浴温度对大蒜中黄酮提取量的影响

由图3可知，大蒜中黄酮的提取量随着水浴温度的升高先增大后减小，当温度低于50 ℃时，大蒜中黄酮的提取量随着温度的升高而增加；当温度超过50 ℃时，大蒜中黄酮的提取量随着温度的升高而减少。这是由于随着温度的升高，溶液中的分子运动速率加快，使得大蒜中黄酮的提取量增加，但当温度升高到一定程度时，大蒜中的其他物质也会溶解到溶液中，并且过高的温度会导致黄酮类化合物氧化，从而降低大蒜中黄酮的得率。所以，最适的水浴温度为50 ℃。

图3 水浴温度对大蒜中黄酮提取量的影响Fig.3 The effect of water bath temperature on the extraction amount of flavonoids from garlic

3.1.4 乙醇浓度对大蒜中黄酮提取量的影响

由图4可知，大蒜中黄酮的提取量随着乙醇浓度的增加先增加后减少，当乙醇浓度达到60%时，大蒜中黄酮的提取量最大，为0.87 mg/g。当乙醇浓度低于60%时，大蒜中黄酮的提取量随着乙醇浓度的增加而增加。当乙醇浓度高于60%时，大蒜中黄酮的提取量随着乙醇浓度的增加而减少。乙醇含有极性，当乙醇浓度达到60%时，溶液中的极性与黄酮中的极性非常相似。所以，选择60%的乙醇浓度作为黄酮提取的最佳条件。

图4 乙醇浓度对大蒜中黄酮提取量的影响Fig.4 The effect of ethanol concentration on the extraction amount of flavonoids from garlic

3.1.5 大蒜黄酮提取工艺正交试验

为了研究大蒜黄酮化合物提取的最佳工艺，通过正交试验对提取工艺进行优化，在单因素基础条件下，研究液料比、乙醇浓度、水浴时间和水浴温度对大蒜中黄酮提取量的影响，以单因素试验结果作为试验数据范围，以A液料比、B乙醇浓度、C水浴时间和D水浴温度作为考察因素，以黄酮提取量作为酒精指标，试验设计及结果见表2。

表2 大蒜黄酮提取正交试验设计及结果Table 2 Design and results of orthogonal test for extracting flavonoids from garlic

由表2可知，影响大蒜中黄酮类化合物提取的因素是水浴时间>液料比>乙醇浓度>水浴温度，优化后的最优大蒜黄酮提取组合为ABCD，即液料比65∶1，乙醇浓度50%，水浴时间3.5 h和水浴温度50 ℃。在此条件下大蒜黄酮类化合物提取量最高，为0.87 mg/g。

3.2 大蒜黄酮类化合物抗疲劳活性研究

人体的疲劳程度可以通过多个方面表现出来。本试验通过对比运动员服用大蒜多糖之前和之后跑400 m花费的时间、运动后的血糖、心跳和血压，并计算平均值，对大蒜中黄酮的抗疲劳活性进行研究。基本的试验操作方法为：选取5个男运动员，进行为期1个月的试验，在试验开始之前跑400 m，测量出每个人的血糖、心跳和血压；每天服用1次大蒜多糖，30 d后，再次跑400 m，记录花费的时间、运动后的血糖、心跳和血压，计算平均值。比较同一组运动员服用大蒜多糖之前和之后的运动时间、运动后的血糖、心跳和血压。

由表3可知，服用大蒜黄酮之后，运动员的各项身体机能都得到了一定程度的提升，说明大蒜黄酮具有一定的抗疲劳功效。

表3 服用大蒜黄酮化合物前后运动员体征变化Table 3 Changes of athletes' physical signs before and after taking garlic flavonoids

4 结论

随着社会的进步，黄酮在治疗人类疾病方面的功效开始被重视，黄酮的开发和提取已经在很多植物中被报道，但是在大蒜中的研究报道相对缺乏。本研究基于此，采用有机溶剂提取法、单因素试验法和正交试验法对大蒜中的黄酮提取进行研究，单因素研究结果表明，最佳的黄酮提取工艺为液料比70∶1，水浴时间3.5 h，水浴温度50 ℃和乙醇浓度60%；正交试验研究结果表明，最佳的黄酮提取工艺为液料比65∶1，乙醇浓度50%，水浴时间3.5 h和水浴温度50 ℃。此外，大蒜黄酮表现出一定的抗疲劳活性。