镉胁迫对绢毛委陵菜-丛枝菌根真菌共生体根系结构和生理的影响

高 冰 高鹏飞 范卫芳 冯郑红 吴建慧

（东北林业大学园林学院，哈尔滨 150040）

绢毛委陵菜（）是蔷薇科（Ro‑saceae）委陵菜属（），多年生草本植物，是一种良好的园林地被植物，易于繁殖管理，具有较强的抗寒性、抗旱性。近年来，重金属如镉对土壤造成的污染成为一个世界性难题，当重金属污染环境后，会随着食物链进入各生物体中，造成重金属在生物体内的富集。据调查，我国北京西郊污水灌溉区表层土壤的含镉量已达到0.53 mg·kg，是当地本底值的5倍左右，每年由于土壤中含镉浓度很高，造成荒废的土地面积日渐增加，因此，镉污染的土地治理日趋重要。

丛枝菌根（AM）真菌可以与大多数植物形成真菌-植物共生体结构，在植物-环境生态系统中具有重要作用，能促进宿主植物的生长发育，也可以提高植物的对镉的耐受性。利用AM 真菌与植物形成共生体系的方法对重金属污染土地进行治理已经引起广泛关注。

以往对接种AM 真菌的植物抗镉性主要为研究与植物互利共生的真菌类型、调查接种后侵染率高低、接种后植物生长量的变化等。通过前期侵染率试验发现绢毛委陵菜接种摩西球囊霉（）侵染率极高，因此本研究以接种摩西球囊霉后的绢毛委陵菜为试验材料，通过根系超微结构观察、丙二醛含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性等生理生化指标测定，进一步从生理生化层面上揭示绢毛委陵菜-丛枝菌根共生系统对镉的响应机制，为利用共生体技术提高绢毛委陵菜的抗镉性能，恢复和改良镉污染土壤提供科学依据。

1 材料与方法

1.1试验材料

于2020年从东北林业大学苗圃实验站将株高为4～5 cm的绢毛委陵菜取回。从北京市农林科学院植物营养与资源研究所及石河子大学绿洲农作物病害防控重点实验室购回摩西球囊霉和根内根生囊霉（）两种真菌接种物，包含菌根片段、真菌菌丝和真菌孢子等，孢子量约为20 个·g。CdCl·2.5HO 溶液购买于温州雨泽科技有限公司。泥炭土、珍珠岩、蛭石、腐殖酸等购于黑龙江省哈尔滨市花卉市场。

1.2试验方法

选取健康、株高、长势一致的幼苗放入清水中缓苗3～5 d 后，注意观察幼苗长势，待幼苗生长正常，剪掉多余老根，剩余一部分新根。

AM 真菌接种处理：将购回的泥炭∶珍珠岩∶蛭石按4∶1∶1的体积比进行混合搅拌至均匀，置于高压灭菌锅中，120 ℃、240 kPa 灭菌4 h，以消除其他真菌孢子的影响，将经过高温高压灭菌的基质土均匀放置在花盆中（口径18 cm），精确称取、2 种丛枝真菌接种物25 g 均匀置于2 cm 表层基质，未接种的则将灭菌后的2 种接种物均匀置于2 cm 表层基质，确保植物生长基质一致。镉处理：每盆基质干重700 g，镉添加以CdCl·2.5HO 水溶液的形式与基质土进行充分混合，不添加镉的则用蒸馏水浇灌作为对照。

将一致的幼苗移至接菌的基质土中，植物生长35 d 内，每周需补充1/4 倍的霍格兰营养液40～50 mL，从36 d 开始每周补充相同营养液90～100 mL，从发芽开始起第80 天，即开始进行镉溶液胁迫处理，处理周期为10 d。采取双因素析因试验设计，试验因素为镉和AM 真菌。设置5 个Cd 浓度处理：Cd0（0 mg•L）、Cd5（5 mg•L）、Cd10（10 mg•L）、Cd15（15 mg•L）、Cd20（20 mg•L），AM真菌包括3 个水平，分别为：不接种、接种、接种，共15 组处理，每组处理3盆，每组3次重复。

1.2.2 菌根侵染率的测定

从不同基质中挖出绢毛委陵菜后，用清水轻轻冲洗根部，将根部附带的杂质等冲洗干净至根部呈黄白色，注意控制水流速度和人为操作手法，以免破环根系。根系清洗干净后，取新鲜根样，精确剪取1 cm 不同粗细的根段保存于FAA 固定液（90 mL 70%乙醇+5 mL 冰醋酸+5 mL 38%甲醛）中，标记后可放入冰箱内4℃密封保存。接种、的绢毛委陵菜各剪取长度约1 cm 的根段100 个，用10%氢氧化钾溶液在90 ℃水浴锅消解60 min 至透明状，用蒸馏水清洗两遍，再用2%的盐酸酸化至少30 min后用蒸馏水清洗2遍，用HO和蒸馏水再各清洗2 遍，用Trypan blue进行染色，乳酸甘油溶液进行脱色处理后制片，按照刘润进等方法测定菌根侵染率。

将接菌成功的绢毛委陵菜根系根尖1 cm左右的长度剪下，取材尺寸为3 mm，再按照张静对电镜观察植物根系超微结构样品的制备方法进行制片，最后用H7650透射电镜进行观察。

超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白含量、叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量均以绢毛委陵菜叶片为材料并运用比色法进行测定。

1.3 数据分析

菌根侵染率采用MYCOCALC 软件计算。利用SPSS 22.0 软件对超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白含量、叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量进行Duncan’s 单因素方差多重比较分析，差异显著水平为0.05。

根系超微结构使用Photoshop 软件进行对图片的处理加工，用Excel 软件对所有数据进行整理，用SPSS 22.0软件进行方差差异性分析。

2 结果与分析

2.1绢毛委陵菜根系菌根共生的结构特征

绢毛委陵菜被摩西球囊霉侵染后，经观察鉴定为Paris（P）型菌根结构（见图1）。侵染绢毛委陵菜的根系，首先形成附着泡和侵入点结构，随后有菌丝进入绢毛委陵菜根内（见图1：a～c），菌丝形态弯曲缠绕、较粗壮，可在表层细胞间直接传播（见图1：a～e），形成数量很少的胞间和胞内连丝（见图1：b～g），其中一部分根内菌丝与根外菌丝真菌结构相连（见图1：c～h），剩余菌丝顶端膨大形成泡囊（vesicles）。菌丝形成丛枝结构的数量较少，往往更多的集中于中柱的几层内表皮细胞之间（见图1：g～h）。细胞内泡囊数量不多，泡囊形态多为椭圆形，也有圆形、长椭圆形等等，有的泡囊内有油状物（见图1：b～c，h～i）。

图1 绢毛委陵菜根根系菌根共生显微结构a.无隔菌丝侵入根系成分枝状H（hypha）；b.无隔菌丝H 及泡囊V（vesicle）；c.异形泡囊V；d.菌丝侵入点H；e.菌丝H 二叉状及顶端膨大成泡囊V；f.已消解成斑点状丛枝A（Arbuscular）及有隔菌丝H；g.菌丝侵入点H；h.丛枝A及圆形泡囊V；i.不规则泡囊VFig.1 Microstructure of symbiosis of roots and mycorrhiza of P.sericeaa.Non-septal hyphae invade root component dendritic H（hypha）；b.Non-septal hyphae H and vesicles V（vesicle）；c.Abnormal vesicles V；d.Hypha invasion points H；e.Mycelium H has a bifurcated shape and swells at the top to form a vesicle V；f.It has been digested into a spotted arbuscular A（Arbuscular）and a septal hyphae H；g.Mycelial invasion point H；h.Witch branch A and round vesicle V；i.Irregular vesicle

2.2绢毛委陵菜根系AM真菌侵染状况

从表1 可以看出，菌根类型均为P 型，在镉质量浓度为0 mg•L、不接菌的对照处理中，未发现有菌根真菌的侵染，即侵染率为0。在镉质量浓度为0 mg•L、接种的绢毛委陵菜菌根侵染率极高，达到100%，接种的绢毛委陵菜菌根侵染率为89.33%。对于接种的处理组，随着土壤基质施镉的浓度由5、10、15、20 mg•L逐渐升高，绢毛委陵菜根系的菌根侵染率表现为逐渐下降，这表明土壤中的丛枝菌根真菌生长受到重金属镉的抑制作用。对于接种的处理组，镉质量浓度水平逐渐提高，根系的菌根侵染率表现为明显下降。

表1 镉胁迫下AM真菌对绢毛委陵菜菌根侵染率的影响Table 1 Effect of AM fungi on the infection rate of P.sericea mycorrhiza under cadmium stress

2.3接种摩西球囊霉真菌的绢毛委陵菜超微结构

由表1可见，在镉胁迫处理下，接种处理的绢毛委陵菜侵染率高于接种处理，因此对接种的植物进行超微结构观察。在镉胁迫下，绢毛委陵菜的细胞结构发生各种变化，植物体内的细胞器数量及每个细胞的大小随着镉质量浓度的变化而发生变化。植物体内细胞质中的线粒体对重金属镉较为敏感，随着镉质量浓度的变化，线粒体的大小和数量也在变化。植物细胞器线粒体结构呈封闭的囊状，有两层细胞膜，主要是由内、外膜、膜间隙及基质构成，内膜向内褶叠成嵴，在透射电镜下，观察到绢毛委陵菜的细胞壁会随着生长期所受外界条件影响而呈现薄厚的转变，同时细胞内的淀粉粒也是随镉胁迫程度的变化而变化的指标之一。

植物正常生长（镉质量浓度为0 mg•L、不接菌）的状况下（见图2a），绢毛委陵菜根系细胞结构整体正常且完整，细胞壁轮廓完整，厚度合适；线粒体大小正常，数量较多，且多为圆形或椭圆形，在细胞内分布广泛；有少量的淀粉粒贴着细胞壁存在，各个淀粉粒的体积较小；液泡体积较大，所占整个细胞的比例也较大。

对于不接菌的绢毛委陵菜，在镉质量浓度为5 mg•L的轻度胁迫（见图2b）下，线粒体数量和大小与正常生长情况下几乎相同；不同的是，细胞壁开始变薄；而线粒体数量减少、体积变小、在细胞内分布范围变大；同时液泡的体积及所占比例变小。在镉质量浓度为10 mg•L中度胁迫下（见图2c），细胞壁的厚度与轻度胁迫下的厚度相比更薄；线粒体的数量大幅减少；淀粉粒的体积变大，且分布在细胞的各个部分。在镉质量浓度为20 mg•L重度胁迫下，和之前胁迫相比，细胞壁出现大面积破损现象；细胞内器官和物质完全被破坏，已分辨不出细胞内部结构（见图2d）。

对于接种摩西球囊霉真菌的绢毛委陵菜，在镉质量浓度为5 mg•L轻度胁迫下（见图2e），线粒体大小较正常生长情况下和同镉质量浓度不接菌情况下偏大，而细胞壁的厚度与之前处理变化一致；淀粉粒数量增多且分布范围变广，液泡所占比例较大。在镉质量浓度为10 mg•L胁迫下（见图2f）与正常状况下相比细胞壁变薄，但是与同等镉质量浓度、不接菌的情况相比，线粒体小幅减少；淀粉粒分布在细胞各处。在镉质量浓度为20 mg•L重度胁迫下，细胞壁出现破损现象，但与同等镉质量浓度、不接菌情况下相比，未完全破损，仍可见细胞的整体轮廓；细胞内无完整细胞器或组织，但有可见的淀粉粒存在于细胞中且分布分散（见图2g）。

图2 绢毛委陵菜根系超微结构a.不接菌、Cd0（×20 000）；b.不接菌、Cd5（×20 000）；c.不接菌、Cd10（×20 000）；d.不接菌、Cd20（×20 000）；e.接菌、Cd5（×20 000）；f.接菌、Cd10（×20 000）；g.接菌、Cd20（×20 000）；M.线粒体；W.细胞壁；S.淀粉粒；V.液泡Fig.2 The ultrastructure of the root system of P.sericeaa.No inoculation，Cd0（×20 000）；b.No inoculation，Cd5（×20 000）；c.No inoculation，Cd10（×20 000）；d.No inoculation，Cd20（×20 000）；E.Inocu‑lation，Cd5（×20 000）；f.Inoculation，Cd10（×20 000）；g.Inoculation，Cd20（×20 000）；M.Mitochondria；W.Cell wall；S.Starch granules；V.Vacuoles

2.4镉胁迫对绢毛委陵菜-摩西球囊霉共生体各指标的影响

绢毛委陵菜用不同浓度的Cd 胁迫处理10 d后，生长状态如图3 所示。如图3a～e 和a1～e1 所示，不接菌的绢毛委陵菜在Cd10 处理下出现叶片边缘泛黄、少许茎出现弯曲状生长；在处理为Cd15时，叶片边缘卷曲泛黄并出现萎蔫现象、茎弯曲明显；当Cd 浓度达到20 mg•L时，植物已基本无法直立生长，叶子发黄并出现大面积萎蔫。从图3：f～j 和f1～j1 中看出，接种处理的绢毛委陵菜在Cd10 处理下仍正常生长，叶片未出现变化；在Cd15 处理下，叶片边缘呈现卷曲和泛黄现象，茎开始弯曲生长；在处理为Cd20 时，绢毛委陵菜较不接菌植株的生长状态更好，叶子发黄程度较轻且少部分叶片出现萎蔫现象。

图3 镉胁迫下绢毛委陵菜-摩西球囊霉共生体的生长指标a，a1.不接菌、Cd0；b，b1.不接菌、Cd5；c，c1.不接菌、Cd10；d，d1.不接菌、Cd15；e，e1.不接菌、Cd20；f，f1.接菌、Cd0；g，g1.接菌、Cd5；h，h1.接菌、Cd10；i，i1.接菌、Cd15；j，j1.接菌、Cd20Fig.3 Growth index of Potentilla sericea L.-F.mosseae symbiont under cadmium stressa，a1.No inoculation，Cd0；b，b1.No inoculation，Cd5；c，c1.No inoculation，Cd10；d，d1.No inoculation，Cd15；e，e1.No inoculation，Cd20；f，f1.Inoc‑ulation，Cd0；g，g1.Inoculation，Cd5；h，h1.Inoculation，Cd10；i，i1.Inoculation，Cd15；j，j1.Inoculation，Cd20

从图4A 中可以看出，SOD 活性整体随着镉质量浓度的增加呈先升高后降低的趋势，Cd0 至Cd10 明显上升（<0.05），Cd10 至Cd15 明显下降（<0.05）。对于不接菌的绢毛委陵菜，在Cd0处理下，SOD 活性为188.6 U•g，当Cd10 处理时，SOD活性达到峰值为340.8 U•g，然后镉质量浓度继续增加到20 mg•L，SOD 活性降到110.9 U•g；对于接种的绢毛委陵菜SOD 活性仍然是随着镉质量浓度的增加呈先升后降的趋势，但不同点在于，当Cd0处理时，SOD 活性为206.3 U•g，当镉质量浓度升高为5、10 mg•L时，SOD 活性逐渐达到更高的峰值为391.0 U•g，然后随着镉质量浓度逐渐增加，SOD活性最终降至150.7 U•g。

从图4B 中可以看出，可溶性蛋白质含量随着镉胁迫浓度增大和时间延长，呈现逐渐降低的趋势，Cd0 至Cd5 明显下降（<0.05），Cd10至Cd15下降不明显（>0.05）。对于不接菌处理的绢毛委陵菜，随着镉质量浓度依次从0 mg•L增加到20 mg•L，可溶性蛋白含量从7.05 mg•g降至0.89 mg•g（<0.05）；对于接菌处理的绢毛委陵菜，可溶性蛋白含量从8.55 mg•g降至1.21 mg•g（<0.05）。

从图4C 中可以看出，叶绿素含量整体呈下降趋势，Cd0 至Cd10 明显下降（<0.05），Cd10 至Cd15下降不明显（>0.05）。对于不接菌的绢毛委陵菜，叶绿素含量在Cd=0 mg•L处理时最高为6.12 mg·kg，当Cd=20 mg•L时最低为0.89 mg•kg；对于接种摩西球囊霉真菌的绢毛委陵菜在Cd=0 mg•L处理时最高为7.59 mg•kg，当Cd=20 mg•L处理时最低为1.21 mg•kg。

图4 镉胁迫下绢毛委陵菜-摩西球囊霉共生体的生理指标Fig.4 Physiological indicators of P.sericea-F.mosseae symbiont under cadmium stress

从图4D 中可以看出，脯氨酸含量整体呈先升后降 的趋 势，Cd0 至Cd5 明 显上 升（<0.05），Cd15～Cd20 处理下植物受损伤严重，生理机能已出现问题。在不接菌处理时，脯氨酸含量在Cd10处理时达到峰值为4 750 μg•g，而接种的植物在Cd10处理时达到的峰值为5 569 μg•g。从图4E 中可以看出，MDA 含量整体呈现上升趋势，Cd5 至Cd10 明显上升（<0.05），Cd10 至Cd15 上升不明显（>0.05）。对于不接菌的绢毛委陵菜，MDA 含量在Cd0 处理时最低为8.56 μmol•g，当Cd20处理时最高为10.20 μmol•g；对于接种摩西球囊霉真菌的绢毛委陵菜在Cd0 处理时 最低 为9.32 μmol•g，当Cd20 处理 时最 高为11.23 μmol•g。

3 讨论

随着土壤重金属污染问题日趋严重，植物与微生物共生修复污染土壤已成为生物修复研究热点，具有巨大发展前景，接种不同的AM 真菌能够改变宿主植物耐受重金属的能力。相关研究表明，当Cd 进入根内，细胞内的氧化还原平衡遭到破坏，产生活性氧基团，AM 真菌能刺激植物激活自身的防御机制来抵御重金属的危害，通过提高植物体内一些抗氧化物酶的活性，达到清除自由基、避免对细胞造成伤害的目的，例如植物叶片超氧化物歧化酶等活性升高。本研究中，在镉胁迫下接种AM真菌，摩西球囊霉对绢毛委陵菜侵染率高达100%，根内根生囊霉侵染率可达到89.33%，这与高璿濛等的研究结果类似。

通过透射电镜可以清楚观察到绢毛委陵菜的根系结构，显示根系细胞组织和细胞的微细结构，以及细胞内各物质的形态大小等。本试验主要对绢毛委陵菜接种AM 真菌再对植物根系细胞进行观察，结果表明，在镉胁迫下，接种真菌可以激活绢毛委陵菜自身防御机制来提高植物抗性，在植物根系主要表现在细胞膜、细胞壁、液泡、线粒体等组织及器官上，均减轻了同等镉胁迫下不接菌植物所受的损伤。当植物受重金属胁迫后，其细胞超微结构改变是植物一系列生理活动异常的细胞学基础，因此研究植物受重金属毒害后细胞超微结构的变化，在今后的研究中对揭示重金属毒害植物的机理有着重要意义。

相关研究发现，植物体内存在一些重要的保护酶，超氧化物歧化酶的活性与植物抗性密切相关，当受到镉胁迫时，植物体内的酶会产生应急机制，提高相关酶的活性，在低浓度胁迫时可以降低重金属对植物造成的伤害。除此之外，植物体内可溶性蛋白含量、叶绿素含量、丙二醛、脯氨酸含量也可以反映植物受到迫害的程度。本研究在低浓度镉下处理绢毛委陵菜，植物体内酶活性会有所提高，植物抗性增强，接种后，与不接菌相比，酶活性和脯氨酸含量显著上升，植物体内的抗性系统显著提高，植物受到的镉胁迫超出特定范围后，酶活性和脯氨酸含量才开始下降。对于可溶性蛋白和叶绿素含量，接菌后植物体内的含量下降相较于不接种处理的植物较慢，在一定程度上减轻镉对植物的伤害。对于丙二醛含量，接菌后植物体内的含量缓慢上升，最低值和峰值均低于不接种的绢毛委陵菜，说明当植物受到镉胁迫时，接菌成功的植物抗性更强。

4 结论

（1）接种的植物菌根侵染率高达100%，而接种的绢毛委陵菜侵染率达89%，并且用镉处理植物后，随着镉质量浓度的升高，侵染率降低，表明重金属镉对土壤中丛枝菌根真菌具有抑制作用。

（2）用镉溶液处理不接种摩西球囊霉的绢毛委陵菜，随着镉浓度升高，植物细胞壁变薄直至破损、液泡变小至破损消失、淀粉粒增多且范围分布广。与摩西球囊霉共生的绢毛委陵菜用镉溶液处理后，当镉质量浓度低时细胞壁轻微变薄、液泡变小并不明显，当浓度达10 mg•L时，细胞壁出现小范围破裂和液泡变小的趋势，高浓度（20 mg•L）镉时，植物细胞壁破裂进而失去细胞原有形态。

（3）在镉胁迫下，接种摩西球囊霉真菌的绢毛委陵菜的生长状态和各生理指标与不接菌相比，变化趋势明显。与不接菌相比，在植物抗镉性方面有所提高，植物体抗性增强。

综上所述，摩西球囊霉真菌比根内根生囊霉真菌的侵染率高，接种摩西球囊霉的绢毛委陵菜在一定程度上提高了对镉的抗性，缓解了镉对植物的毒害。