东北林下早春植物开花的生理特征研究

潘立本 闫 雪 刘 佳 吴可心 刘 洋 刘少冲

（1. 东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；2. 东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040；3. 中国森林博物馆，哈尔滨 150040）

早春开花植物一般为生长在落叶阔叶林下的一些多年生植物，其生命周期短，在早春冰雪初融时迅速展叶，经过短暂的营养生长后在早春开花，并在林冠上层植物展开叶片前完成生活史然后进入休眠状态，对林下低光潮湿的环境适应性较强，同时也具备一定的观赏和药用价值。在全球气候变暖的背景下，人们对早春开花植物的地理分布、资源价值、抗寒性、开花调控的生理机制等方面研究增多。其中，植物激素和次生代谢物是调控植物开花的关键物质，我们目前对此方面的理解还不够深入。

内源激素在植物整个生命周期都发挥着重要的调控作用。Khan等提出，调节植物生长和发育始终是多种植物激素共同作用的结果，植物激素对花发育的调节不是由任何单一激素决定的。韩忠海等的研究表明，在羊草拔节期，叶面喷施GA 和KT 对羊草的开花和结实有促进作用。还有研究发现，在罗汉果花芽分化过程中，GA和IAA含量上升，而ABA 和ZR 含量的降低，且高比值的ABA/GA和ZR/GA有利于花芽分化。

酚类代谢物属于植物的次生代谢产物，在植物中起着重要的作用，它们也参与了植物的开花过程。之前的研究在花中以及开花过程中发现了黄酮醇类物质的积累，进一步证明了关于黄酮醇可能在植物生殖发育中发挥关键作用的假说。另外，还有研究发现在花粉形成、花粉粒萌发和花粉管生长的过程中，IAA 和类黄酮的含量均增加，说明雄性配子体的形成在很大程度上取决于内源性IAA 和类黄酮的水平。在早春植物开花植物中酚类代谢物的含量及变化还有待进一步研究。

东北林下早春开花的草本植物主要集中在百合科（Liliaceae）、堇菜科（Violaceae）、毛茛科（Ra‑nunculaceae）等。本研究选用的早春开花植物冰凌花（Regel et Radde）、黑水银莲花（（Korsh.）Kom.）、平 贝 母（Maxim）、鹿药（A. Gray）、顶 冰 花（（L.）Ker-Gawl.）以及非早春开花植物耧斗菜（Pall.）、升麻（L.）、乌头（Debx.）、藜 芦（L.）和东北百合（Nakai），它们都分布在百合科和毛茛科，是东北地区代表性的早春植物。目前对这些植物的研究主要集中在形态学、开花特性、繁殖与栽培、分子生物学和药用成分等方面。本研究通过对比分析早春开花植物和非早春开花植物在植物内源激素方面的差异，同时对二者之间的酚类代谢产物进行检测及分析，进一步揭示早春开花植物在低温下开花的生理特征变化。

1 材料与方法

1.1试验材料

本试验选取的5 种早春开花植物为：冰凌花、黑水银莲花、平贝母、鹿药、顶冰花，它们的花期都在4—5 月；5 种非早春开花植物为：升麻、乌头、耧斗菜、藜芦、东北百合，它们的花期在7—8 月。采样时间为2019 年4 月中旬，在东北林业大学帽儿山 实 验 林 场 老 山 地 区（45°16′23.94″N，127°34′35.67″E），首先建立1 个10 m×10 m 的典型样地，在样地内以四角及中心位置设置5 个1 m×1 m的样方，在样方内随机采集10种目标植物，采集部位为植物中部成熟叶片，每种植物3 个生物学重复。样品经蒸馏水清洗去除表面杂质，液氮速冻后保存至冰箱中-80 ℃保存备用。

1.2内源激素的提取、纯化与检测

参照Mornya等的方法进行内源激素赤霉素（gibberellin，GA）、生 长 素（indole-3-acetic acid，IAA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）和玉米素（ze‑atin，ZT）的提取。将0.50 g叶片样品在10 mL 含有1 mmol·L2，6-二叔丁基对羟基甲苯的80%冷甲醇中研磨成匀浆。将匀浆转移至试管中，并加入20 mg 聚乙烯聚吡咯烷酮，充分混合均匀后在4 ℃下孵育过夜。孵育结束后6 000 r·min离心20 min，收集上清液，将沉淀在2 mL冷甲醇中萃取12 h，离心后再次收集上清液。合并两次上清液，使用1 mol·LHCl 将其pH 值调节至2.5～3.0，并用等体积的乙酸乙酯中提取3次。

通 过C18 Sep-Pak 柱（Waters Corp.，Milford，MA）进行激素纯化。先后用纯甲醇和去离子水淋洗柱子2 次，再用注射器将样品加入到柱中，最后用1 mL 80%的甲醇水溶液洗脱2次。洗脱后的组分用真空离心浓缩仪LSE-3K（常州金坛良友仪器有限公司）挥干，重新溶解于0.2 mL 80%的甲醇中，待测。

利用高效液相色谱（UPLC）系统和三重四极杆飞行时间（Q-TOF）串联质谱仪（Xevo G2-XS QTof，Waters Corp.，USA）进行检测。检测参数为：毛细管电压3500 V、碎裂电压135 V、源温度350 ℃、雾化压力40 psi。检测在ESI+模式下进行，质荷比（/）范围为50～1 200。流动相以0.5 mL·min的流速进行梯度洗脱：（A）0.04%乙酸-水，（B）0.04%乙酸-乙腈；从0 min 时的5%B 到20 min 时的95%B 到22.1 min 时的5%B，然后保持在5%B直到28 min。

1.3酚类代谢物的提取与检测

根据刘洋的方法进行样品制备：将植物叶的干燥粉末0.5 g 放入25 mL 离心管中，加入70%甲醇10 mL，利用超声辅助提取法常温提取45 min，然后8 000 r·min离心10 min，取上清液；再次加入10 mL 的70%甲醇，超声后离心，将两次上清液合并；放入真空离心浓缩仪挥干后，加入1 mL的70%甲醇复溶，冰箱中-20 ℃保存。

用高效液相色谱（UPLC）系统和四极杆飞行时间（Q-TOF）串联质谱仪（Xevo G2-XS QTof，Wa‑ters Corp.，USA）进行测定。参数如下：毛细管电压3 000 V，源温度500 ℃，检测在ESI+模式下进行，质荷比（/）为50～1 200。通过ACQUITY C18 色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm；Waters，中国上海）进行样品的分离，梯度洗脱使用以下溶剂系统进行：（A）0.05%甲酸-水，（B）0.05%甲酸-乙腈；流速0.5 mL·min，从0 min 时的5%B 到20 min 时的95%B 到22.1 min 时的5%B，然后保持在5%B 直到28 min。

1.4数据处理

使用软件MassLynx 4.1 对UPLC-MS 数据进行分析，按照标准曲线计算得到提取液中各内源激素和酚类化合物的含量（μg·mL）。用SPSS 22.0进行数据的统计、归一化处理以及方差分析，数据以“平均值±标准误”表示。总体比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较采用Mann-Whitney检验，以<0.05 作为判断差异显著性的标准，<0.01 表示有极显著差异。酚类化合物数据使用MetaboAnalyst 5.0网站进行聚类分析，其他试验数据用GraphPad Prism 8作图。

2 结果与分析

2.1内源激素含量比较分析

植物的内源激素与开花的关系是复杂的，通过激素之间的相互作用，可以影响可溶性糖、蛋白质以及其他营养物质，从而控制植物开花。综合分析两类植物的内源激素ABA，GA，IAA，ZT 的比例，我们发现早春开花植物中的IAA/ABA，ZT/ABA，（IAA+GA）+ZT/ABA值均显著低于非早春开花植物（见图1），而GA/ABA 在两类植物中差异不显著。由图2可知，ABA/GA在两类植物中无显著差异，但IAA/GA和ZT/GA在早春开花植物中都显著低于非早春开花植物。早春开花植物与非早春开花植物中IAA 的差异显著（见图3），GA/IAA，ABA/IAA，（GA+ABA+ZT）/IAA 的值在早春开花植物中显著高于未开花植物，由此可见早春开花植物中的IAA 含量较低。同时，早春开花植物中GA/ZT，ABA/ZT 和（IAA+GA+ABA）/ZT 的值均显著高于非早春开花植物（见图4）。综上所述，在早春开花植物中分布较多的植物激素是GA和ABA，且GA/IAA 和ABA/IAA 的值与非早春开花植物相比普遍较大。

图1 早春开花植物和非早春开花植物中其他激素与ABA的比例1.冰凌花；2.黑水银莲花；3.平贝母；4.鹿药；5.顶冰花；6.耧斗菜；7.升麻；8.乌头；9.藜芦；10.东北百合；不同小写字母表示早春开花植物差异显著（P<0.05）；不同大写字母表示非早春开花植物差异显著（P<0.05）；*表示早春开花植物与非早春开花植物组间存在差异（P<0.05），**表示两组间差异极显著（P<0.01），ns表示两组间无显著差异；下同Fig.1 The ratio of other hormones to ABA in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants1.Adonis amurensis；2.Anemone amurensis；3.Fritillaria ussuriensis；4.Smilacina japonica；5.Gagea lutea；6.Aquilegia viridiflora；7.Cimicifuga foetida；8.Aconitum carmichaeli；9.Veratrum nigrum；10.Lilium distichum；Different small letters indicate the significant difference between early spring flowering plants（P<0.05）；Different capital letters indicate the significant difference between non early spring flowering plants（P<0.05）；* indicates the difference between early spring flowering plants and non-early spring flowering plants（P<0.05），** indicates the extremely signifi‑cant difference between group（sP<0.01），ns indicates that there is no significant difference between the two groups；The same as below

图2 早春开花植物和非早春开花植物中其他激素与GA3的比例Fig.2 The ratio of other hormones to GA3 in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants

图3 早春开花植物和非早春开花植物中其他激素与IAA的比例Fig.3 The ratio of other hormones to IAA in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants

2.2目标酚类化合物分布情况

本研究所检测的31 种酚类化合物，按照其结构式判定芳香环上的碳被羟基替代情况、酚羟基的多少及分布状况和取代基的类型将化合物分为C6C1 骨架、C6C3C6 骨架和C6C3 骨架，及其他相关信息均列于表1。将目标代谢物数据标准化后，进行聚类分析以获得两类植物叶片中酚类化合物分布的热图。如图5所示，在早春开花植物中显著积累的有-苯丙氨酸，C6C3 骨架化合物：迷迭香酸、对羟基肉桂酸和肉桂酸；C6C1 骨架化合物：龙胆酸和苯甲酸；C6C3C6 骨架化合物：甘草素、大豆苷元、芦丁、柚皮苷、紫云英苷、异槲皮苷和花旗松素。而C6C3 骨架化合物：咖啡酸、绿原酸、阿魏酸和芥子酸；C6C1 骨架化合物：原儿茶酸、丁香酸和香草酸；C6C3C6 骨架化合物：异甘草素、染料木素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、橙皮素、柚皮素和染料木苷和白杨素在早春开花植物中积累较少，它们大量积累于非早春开花植物中。

图5 两类植物叶片中酚类化合物的聚类分析Fig.5 Hierarchical cluster analysis of phenolic compounds in two types of plant leaves

表1 基于LC-MS测定的目标代谢物基本信息Table 1 Basic information of target metabolites based on LC-MS

3 讨论

内源激素参与植物的整个生命过程，并通过在植物体内建立复杂而完整的信号网络，传输外源或内源信号来促进植物生长和发育。激素平衡假说最早由Luckwill提出，植物的花芽分化可以通过CTK/GA 或GA/CTK 的平衡进行调控，同时控制各种营养物质的代谢。本研究对早春开花植物和非早春开花植物中的内源激素的比值进行了比较分析，发现早春开花植物中其他激素与IAA 的比值高于非早春开花植物，而IAA 与其他激素的比值显著较低（见图3），表明早春开花植物中IAA 的含量低于非早春开花植物。生长素在花原基的萌发和花的发育中起作用。先前的研究结果表明，作为主要生长激素的生长素（IAA）可以响应低温刺激植物生长，IAA 含量的降低促进了小麦（）花的发育。Huang 等也发现IAA 下调会降低bra-miR393 的表达，从而进一步调节植物开花。我们的研究结果进一步证实了IAA 在植物响应低温和促进开花中的作用。有些学者认为赤霉素可以参与植物的开花调控，诱导植物进入花期并调节花的发育，例如甘蓝型油菜（）开花过程中赤霉素的内源性水平上调。在本研究中，早春开花植物中IAA/GA值低于非早春开花植物（见图2），也证明了赤霉素在早春开花植物中的含量较高。同时我们观察到，早春开花植物中IAA/ABA，ZT/ABA，（IAA+GA+ZT）/ABA的值均显著低于非早春开花植物（见图1），说明早春开花植物中ABA含量相对较高。生理研究表明，花蕾分化过程中苹果（）的ABA 含量逐渐增加，可以看出高浓度的ABA 促进花芽分化；但是ABA 的含量过高会抑制龙眼花蕾的形成。在草本植物中，ABA 在菊花（）花芽分化过程中也逐渐增加。之前还有研究发现较高浓度的ABA 在毛竹（）花的发育过程中起着促进作用。在本文研究结果中，GA/ZT，ABA/ZT 值以及（IAA+GA+ABA）/ZT 在早春开花植物中显著高于非早春开花植物（见图4），由此可见，ZT 在早春开花植物中的含量有所降低。这一结果在先前的研究中也有报道，细胞分裂素在低温条件下根系合成的细胞分裂素上运受阻，因而地上部含量较低，但是目前关于细胞分裂素在植物开花中的作用中还有待进一步研究。此外，早春植物中较低的IAA 含量和较高的ABA 和GA含量也证明开花期间植物的激素调节趋于平衡，激素之间的这种平衡调控植物的开花过程。

图4 早春开花植物和非早春开花植物中其他激素与ZT的比例Fig.4 The ratio of other hormones to ZT in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants

植物激素可以调控植物的生长发育及其对环境的适应。已有研究发现，不同植物激素之间存在大量的互作，并且每种激素作用的发挥取决于特定激素的组合，而不是单个激素的作用。在激素的信号转导方面也是如此，植物激素的信号转导途径存在着复杂的交互作用，同一个调控蛋白也可能在多条信号途径中起作用。DELLA 蛋白在GA 信号转导途径中作为核心负调控因子发挥功能，DELLA 蛋白还作为多个信号通路交叉互作的节点发挥功能，相关研究一直是热点。拟南芥（）中的研究提供了由DELLA蛋白RGA介导的生长素和赤霉素信号串扰的直接证据。番茄（）中的研究表明果实萌发过程中生长素与赤霉素的信号串扰是通过SlDELLA 和SlARF7/SlIAA9 复合物介导的。两者的协同作用对植株的生长调控具有重要意义，DELLA 蛋白可直接抑制PIF（PHYTO‑CHROME INTERACTING FAC-TOR）蛋白的转录活性，而PIF蛋白对生长素的生物合成具有促进作用。同时，DELLA 蛋白在ABA 的合成与信号转导中也发挥着重要作用。于磊研究表明，水曲柳中DELLA 可促进ABA 的生物合成并在逆境条件下增强ABA 信号转导。我们的研究也表明，在早春开花植物中，GA 和ABA 的含量较高时，IAA会有所降低，进一步证明激素在信号转导过程中存在互作。

植物中的大多数酚类物质都是通过莽草酸途径合成的，并以-苯丙氨酸为前体物质。早春开花植物中的-苯丙氨酸相对含量显著高于非早春开花植物，说明酚类化合物积极参与了植物开花这一生理过程。Dai 等曾发现用苯丙氨酸拮抗剂DL-P-氟代苯丙氨酸处理不同时期的日本牵牛花，会抑制其开花，与本研究一致。C6C1 骨架的酚类化合物香草酸、丁香酸和原儿茶酸在早春开花植物中的相对含量较低，而龙胆酸和苯甲酸在开花植物中显著积累。原儿茶酸是植物多酚（如花青素）的主要酚类代谢产物，在早春开花植物中观察到原儿茶酸的相对含量较低，多酚含量在早春开花植物中可能也积累较少。有研究表明，苯甲酸、肉桂酸在大麦根对磷和钾等营养元素的吸收过程中起阻抑作用，且香豆素和苯甲酸使大麦胚的蔗糖含量增加，说明苯甲酸与糖类合成关系密切，本研究中苯甲酸在早春开花植物中显著积累，可以推测早春开花植物中糖类含量的增加。具有C6C3 骨架的化合物对羟基肉桂酸、迷迭香酸，以及肉桂酸在早春开花植物中显著积累，而阿魏酸、绿原酸和咖啡酸在开花植物中含量较低。有研究发现-香豆酸和肉桂酸可以使氧化磷酸化与呼吸链的偶联遭到破坏，进而影响植物的呼吸作用。在我们的研究中，早春开花植物中肉桂酸含量的积累可能与其在低温环境中呼吸速率降低有一定关系。本研究发现具有C6C3C6 结构的酚类化合物占最大比例，这些酚类化合物通常被归类为与植物花瓣颜色以及授粉相关的黄酮类物质。在本研究中，芦丁、柚皮苷、甘草素、大豆苷元和异檞皮苷在早春开花植物中显著积累，而柚皮素、染料木苷、染料木素、橙皮素、白杨素、高良姜素和芹菜素在开花植物中含量较低。染料木苷、橙皮素、白杨素和高良姜素在非早春开花植物中有较多分布，这可能是由于它们在早春植物的开花过程中发挥了作用而引起了大量损耗，例如芹菜素。芹菜素是一种天然的黄酮类化合物，之前有研究发现芹菜素可能承担开花期间吸引传粉者的任务。本研究观察到芹菜素在两类植物中的分布差异很大，在未开花植物中积累较多，可能是由于早春开花植物将大量芹菜素用于授粉而导致的。目前关于植物中酚类化合物的研究报道很多，但同时针对多个物种类型的酚类化合物分析却很少。我们的研究发现，早春开花植物和非早春开花植物在酚类代谢物的分布上有很大差异，正是这种差异导致了早春开花植物通过外界低温环境的刺激而完成开花调控，处在相同环境的未开花植物却仍处于营养生长阶段。这不仅有助于我们进一步了解早春开花植物的开花策略，同时也对早春植物的深入研究具有重要意义。

4 结论

本研究通过对早春开花植物与非早春开花植物的内源激素比值以及酚类代谢物含量进行综合分析，进而了解早春开花植物在低温环境下开花的生理特征。研究结果表明，早春开花植物中的IAA 和ZT 含量明显低于非早春开花植物中的IAA含量，而GA和ABA 含量较高。另外，酚类代谢物的前体物质-苯丙氨酸在早春开花植物中含量较高，表明酚类化合物积极响应了早春植物开花这一过程；同时，C6C1 骨架化合物香草酸、丁香酸和原儿茶酸，C6C3 骨架化合物阿魏酸、绿原酸和咖啡酸，以及黄酮类化合物芹菜素、染料木苷、橙皮素、白杨素和高良姜素在未开花植物中有较多分布，这可能是由于它们在早春植物的开花过程中发挥了作用而引起了大量损耗。这些发现不仅有助于我们对早春开花植物的进一步认识，并为早春开花植物的鉴定、人工生产、栽培和开发利用奠定了理论基础。