动物脂肪肝模型构建研究进展

王译彬，刘 瑞，刘南南，杨小军*，刘艳利*

(1. 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100； 2. 广饶县畜牧业发展服务中心，山东 东营 257300)

当肝内脂肪超过肝重量的5%或50%以上肝细胞有脂肪变性时，就称之为脂肪肝，目前脂肪肝已成为世界上最广泛存在的慢性疾病，并伴有许多并发症，会增加2型糖尿病、心血管(cardiovascular disease, CVD)、心脏病和慢性肾病的风险。脂肪肝主要影响肝脏结构和功能，导致肝硬化、肝功能衰竭，且脂肪肝患者的大多数死亡原因为CVD，严重影响了人类健康。在笼养蛋鸡养殖过程中，蛋鸡脂肪肝综合征是造成其死亡的主要原因，且在蛋鸡产蛋期，患脂肪肝的鸡群产蛋率一般上升到85%左右便逐渐下降，不会出现产蛋高峰，且降低蛋重、鸡蛋受精率和受精蛋的孵化率，给畜牧产业造成了一定经济损失。有研究对比分析了种公鸡和种母鸡患脂肪肝后其后代脂肪肝的发生率，发现患脂肪肝种公鸡的后代脂肪肝的发病率更高，表明蛋鸡脂肪肝具有一定的父系遗传效应。奶牛围产期能量负平衡导致脂肪动员过多，游离脂肪酸堆积至肝脏也容易发生脂肪肝疾病，导致肝脏功能受损影响奶牛健康。在畜禽养殖过程中，遗传、环境、营养和激素等因素都可导致畜禽动物脂肪肝的发生，该疾病的发展是一个受多因素调控的复杂过程。

另一方面，脂肪肝发病是一个慢性的病理过程，从最初只是甘油酯沉积、并无炎症发生的简单脂肪变性，到有明显炎症浸润出现的脂肪性肝炎，再到不同程度纤维化的肝硬化，肝硬化又会慢慢演化成肝癌；每个阶段大约有10%～20%的几率往下一阶段演变，但也有少许比例的患病可逆，尤其是在简单脂肪变性和脂肪性肝炎阶段，当消除肝内多余堆积脂肪后，肝功能将恢复正常，因此很多研究人员通过建立脂肪肝模型来开展相关研究，旨在探究脂肪肝的发病机制和预防治疗靶点。因此了解动物脂肪肝模型的构建非常有必要，本文主要介绍了目前科学界常见的动物脂肪肝构建模型，期望能够为今后人类和畜禽脂肪肝相关疾病的研究提供参考依据。

1 动物脂肪肝发病机理

脂肪肝的发病机理非常复杂，具有多样性与异质性，主要因素是代谢紊乱造成的肝细胞脂质积累，及其与炎症反应、细胞应激和细胞死亡的相互作用等。具体来说，当肝脏合成脂质的速率超过分解代谢和胞外转运速率时，就会引起脂肪变性。而脂肪变性的病因与营养异常、胰岛素抗性密切相关，并进一步导致了肝损伤和炎症。被广泛认可的“多重打击”学说认为，脂肪肝的发病与两次打击有关，最初的打击是胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)引起以甘油三酯形式储存的游离脂肪酸的摄取和合成增加，从而导致简单的脂肪变性，进一步包括氧化应激、炎症介质、凋亡攻击等多次攻击可能会使疾病向更晚期发展。产蛋高峰期的蛋鸡需要合成卵黄中所含的脂类物质，且鸡脂质合成主要发生在肝脏中，产蛋后期的蛋鸡有着较高的脂肪沉积，可能会产生脂质代谢失调、氧化性损伤等一系列生理健康问题，易引发脂肪肝出血综合征(fatty liver hemorrhagic syndrome, FLHS)等代谢疾病；奶牛围产期体力不足导致采食量不足，引起能量负平衡，致使机体发生大量体脂动员，造成游离脂肪酸增多，这两种情况均易引发脂质代谢紊乱，导致脂肪肝相关疾病的发生。很多研究也从脂质合成与分解层面探究与脂肪肝发生相关的代谢通路，主要包括Insulin-AKT通路、葡萄糖-ChREBP通路、PPARγ通路、AMPK通路、SIRT1通路、cAMP通路等。

2 脂肪肝模型构建原理

根据脂肪肝发病机理，可将构建原理分为以下5类：(1)通过改变日粮营养结构，使动物摄入或合成过多脂肪，或对日粮进行特殊处理，使动物肝脏受损，构建脂肪肝模型；(2)寻找自然发生的特定基因突变，或靶向基因修饰，诱导动物产生肥胖、肝脏脂肪变性等症状；(3)使用药物或激素，干预动物脂肪合成与代谢过程，模仿脂肪肝症状；(4)日粮与基因敲除或药物多种模型混合诱导，使脂肪肝模型构造周期缩短，症状更加全面；(5)使用天然动物细胞作为脂肪紊乱模型，无需额外药物试剂诱导。

3 动物活体模型

3.1 日粮诱导模型

日粮模型是最常用的诱导方式，相对简单，操作方便，但往往需要的诱导周期较长，常用来诱导肥胖和IR相关脂肪肝病的日粮类型包括以下几种。

3.1.1 高脂日粮诱导 高脂日粮(high fat diet, HFD)模型是最基础的非酒精性脂肪肝病造模方式，此模型大致模拟了西方日粮。HFD中含有较多的脂肪合成原料，可促进肝脏脂肪生成，过度堆积脂肪，从而导致脂肪肝。长期喂食HFD后，动物主要会出现肥胖、IR、单纯脂肪变性等症状。常见的HFD包含71%脂肪、11%碳水化合物和18%蛋白质。最早的研究使用雄性大鼠构建了经典HFD模型，处理时长为3周，造成炎症程度较轻。也有研究通过饲喂19周龄的蛋鸡高脂日粮连续6周，通过肝脏HE和油红O染色可明显看到脂肪肝现象。炎症严重程度与处理时间成正比，目前对于非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)模型，大部分研究的HFD诱导时长为12～20周。

3.1.2 高果糖日粮模型 果糖与脂肪肝的发病机制密切相关，研究表明高果糖(high fructose, HF)扰乱了肝脏的碳水化合物代谢，导致甘油三酯合成率提高，加速脂肪生成，也能促进肝脏炎症和细胞应激，如氧化和内质应激，导致单纯脂肪变性发展为NASH。有研究对雄性Wistar大鼠使用含10%果糖的饮用水和日粮饲喂8周，发现大鼠表现出脂肪肝的特征，体重、IR、血清肝毒性标志物和脂质显著增加(<0.05)，鞘氨醇激酶/1-磷酸鞘氨醇信号通路被破坏，且出现了一定的组织病理学变化。

3.1.3 高脂高糖日粮模型 高脂高糖(high-fat and high-fructose, HFHF)日粮结合了HFD与高果糖日粮模型，是构建脂肪肝炎和2型糖尿病模型的理想选择。有研究对8月龄雄性大鼠饲喂HFHF(55%脂肪、35%碳水化合物和10%蛋白质)日粮8周，与HF组相比，出现了更严重的肝脏氧化应激，肝巨噬细胞聚集增加，诱导持续高胰岛素血症和空腹高血糖，加重了肝纤维化。而HF组与HFHF组的体重和脂肪质量均有所增加，NADPH氧化酶通路改变导致肝脏糖原水平下降，且出现了脂肪变性和IR。同时有研究表明6周龄F8基因敲除雄性小鼠在30%脂肪、18%粗蛋白和50%(w/w)果糖日粮饲喂14周后发生肝脏脂肪变性，并显示出较低的能量代谢，较高的骨髓细胞浸润，血小板计数减少，新的脂肪酸合成上调，脂质积累和胶原蛋白沉积，炎症标志物的表达一致升高，G6Pase显著上调(<0.01)，提示肝脏处于高血糖状态，但无IR发生。研究表明HFHF日粮饲喂小鼠超过26周后可模拟人类NASH的关键特征，30周后可诱导更严重的肝纤维化和炎症。

3.1.4 高脂高胆固醇日粮模型 高胆固醇摄入可诱发血脂异常和IR，诱导脂肪肝机制与HFHF模型类似。对受精后8 d的斑马鱼幼鱼饲喂含12%脂肪、50%粗蛋白和5%(w/w)胆固醇的高胆固醇日粮，在1或2周可建立典型的非酒精性脂肪性肝病模型，3周可建立NASH模型。而更为常见的是高脂高胆固醇(high fat and high cholesterol diet, HFHC)日粮，使用含1.25%胆固醇，15%可可脂和0.5%胆酸的HFHC日粮饲喂10周龄雌性C57BL/6J小鼠，6周后发现雌激素缺乏的HFHC小鼠脂肪性肝炎更严重。对6周龄雄性SD大鼠饲喂80.5%标准日粮、2%胆固醇、7%猪油、10%蛋黄粉和0.5%胆酸钠，8周后体重增长为201.48±22.60 g，与接受普通饲料的大鼠的体重增长(207.24±24.05 g)没有显著差异(>0.05)，但发生了血脂异常和肝损伤，可以确定为NASH。使用含10%大豆油、1.25%胆固醇的HFHC日粮饲喂雄性白兔持续8周，通过HE染色、测定总胆固醇和甘油三酯等物质含量可发现脂肪肝症状。

3.1.5 高能低蛋白日粮模型 家禽FLHS的外部特征是体重增加、产蛋量减少，常见于蛋鸡、病理组织学特征为腹部脂肪过多、脂肪肝、肝脏和血肿中的毛细血管出血。研究发现，单独的HF或低蛋白(low protein, LP)日粮对蛋鸡的肝脏颜色评分、肝脏出血评分或肝脏脂肪含量无显著影响(>0.05)，且所有表示肝损伤的血浆酶仅在LPHF日粮组中发现较高水平，表明提供较高代谢能的LPHF日粮可能是诱发该综合征的病理自然方式。常见的高能量低蛋白(high energy and low protein, HELP)日粮主要添加了70%玉米、15%豆粕和4%大豆油，含13.0 MJ/kg能量和12%粗蛋白，诱导时长为9周。研究表明，HELP日粮可激活PI3K/Akt/TOR信号通路，诱导蛋鸡微泡性脂肪变性，并导致高水平的IR、氧化应激和炎症，与FLHS症状相似。

3.1.6 蛋氨酸和胆碱缺乏日粮模型 蛋氨酸和胆碱在脂肪酸β氧化和脂蛋白的合成中必不可少，脂蛋白在脂质跨膜转运中起重要作用，所以蛋氨酸和胆碱缺乏(methionine-and choline- deficient, MCD)日粮也常被用来诱导NASH模型。常见的MCD日粮含40%蔗糖、10%脂肪，但缺乏蛋氨酸和胆碱。研究发现，对8～10周龄雄性小鼠饲喂MCD 2～3周，肝脏巨噬细胞亚群中Tim-3表达显著增加(<0.05)，其严重程度与肝脂联素抵抗和肝细胞的成脂转化有关，因此MCD模型对肝脏损害较大，但未导致肥胖等症状。并且此模型对雄性小鼠的影响比雌性小鼠更严重。也有研究使用高能量低胆碱(high-energy and low-choline, HELC)日粮(16%粗蛋白、12.2 MJ/kg、0.06%胆碱)饲喂80周龄蛋鸡8周，发现其肝脏肿大，颜色呈淡黄色或黄褐色，且PPAR-ACAD/ACOT和PPAR-LXRα-SREBP1c-ACC/FAS/FAT通路被激活，脂质合成提高，呈现明显的FLHS症状，包括破裂、出血等。

3.2 基因编辑诱导模型

遗传模型作为常见的脂肪肝诱导模型，能够使动物产生肥胖、脂肪变性、IR等症状，无时间限制，可以相对清晰解释某些基因在脂肪肝发生中的作用机制，但一般不会自发产生炎症，因此需结合日粮模型才能相对完整的模仿脂肪肝症状。

3.2.1和肥胖基因(obese gene,)所表达的瘦素通过影响新陈代谢和食欲来调节体重和脂肪沉积，其含量与脂肪沉积程度成反比，瘦素受体是由糖尿病相关基因(基因)编码产生的蛋白质，基因所编码的瘦素受体缺失容易引起高血糖症或IR。或小鼠先存在隐性突变，先天缺少显性或基因，无法编码瘦素或瘦素受体，其特征是肝脏脂质积累增多，不自发产生炎症和纤维化，表现出脂肪肝的明显代谢特征，是脂肪肝的良好遗传模型，两者不同之处在于，小鼠可以抵抗肝纤维化，而小鼠却不抵抗肝纤维化。然而，先天性瘦素缺乏或基因突变引起的瘦素抵抗在肥胖或NASH患者中并不普遍，因此和小鼠模型在反映动物肥胖或NASH的成因方面能力有限。

3.2.21基因编码的蛋白在微管组织，特别是在纤毛的形成和维持中发挥作用，该基因的突变在临床会导致Alstrom综合征，具体表现为感觉缺陷、心脏疾病，代谢型肥胖和2型糖尿病。小鼠具有突变的1基因，其肝脏甘油三酯含量增加，但血清中含量变化不大，其表型为暴食导致的病态肥胖。研究表明，1基因突变的BALB/c小鼠和C57BL6/J小鼠相比，脂肪肝相关症状较轻。有研究对小鼠注射二乙基亚硝胺，发现在12周龄出现肝脏脂肪变性、IR、异常增生肝细胞数量增加、肝结节等脂肪肝典型特征。

3.2.3-小鼠被认为是适合于人类非胰岛素依赖性糖尿病的多基因模型，等位基因(-)的引入会加剧病理生理状况，从而导致明显的糖尿病伴随高胰岛素血症，而糖尿病患者中约50%可发生脂肪肝。-小鼠模型下丘脑食欲抑制受损，易导致暴饮暴食，自发肥胖，血浆胰岛素水平在2至4个月龄明显增加，尿糖和微量白蛋白水平以及白蛋白与肌酐的比率随年龄增长而增加，且对MCD日粮诱导的NASH表现出更高的易感性。

3.2.4-过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，)基因所编码的PPARs影响参与细胞增殖、细胞分化以及免疫和炎症反应的目标基因的表达，共有3种亚型(α、β/δ和γ)。其中PPAR-α是动物肝脏中过氧化物酶体、线粒体和微粒体脂肪酸氧化系统相关基因的关键调控因子，因此-基因敲除小鼠的脂肪酸氧化相关基因表达降低，出现脂肪肝表型。

3.2.5法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)在调节胆汁酸、脂质和葡萄糖稳态中发挥重要作用。基因敲除小鼠会自发地发生肝肿瘤，有研究使用基因敲除小鼠作为模型，发现和的相互作用可能在脂肪肝的发病机制中起重要作用。

3.2.6基因所编码的载脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)主要在肝脏中合成，血浆ApoE水平升高可能预示了脂肪肝的发生。基因敲除小鼠缺乏ApoE蛋白，小鼠发育正常，但血浆胆固醇水平显著增加(<0.05)，表现出脂肪肝的典型症状，且发生了自发性动脉粥样硬化病变。

3.2.7 OLETF大鼠模型 OLETF(Otsuka Long- Evans Tokushim a Fatty)大鼠由肥胖大鼠近交育成，是自发持续高血糖动物模型，其特征包括肥胖、脂肪变性、IR和血脂异常等，症状与人类2型糖尿病类似，而2型糖尿病通常伴有一些代谢性疾病，如脂肪肝和高血压等，因此也被作为脂肪肝动物模型，其对照组通常使用LETO大鼠。

3.2.8 肥胖型Zucker大鼠模型基因是瘦素受体的显性基因，基因失去了与瘦素受体的结合能力，是由基因发生突变的隐性基因。肥胖型Zucker大鼠的基因型为，不能表达正常的瘦素受体。而瘦型Zucker大鼠的基因型为或，能够正常表达瘦素受体，常与肥胖型Zucker大鼠做对照试验。肥胖Zucker大鼠是一种自发性遗传性肥胖模型，标准日粮自由采食的情况下在5周龄已经发生明显的体重和脂肪增加，由于IR，其通过增加胰岛素的合成和分泌形成高胰岛素血症从而代偿性地维持血糖，处于II型糖尿病早期阶段，表现为暴饮暴食、高胰岛素血症和高血脂，是脂肪肝的良好模型。

3.2.9 日粮与基因编辑结合模型 基因编辑模型无法独立发展为脂肪肝，因此许多动物模型结合自然发生的基因突变或靶向基因修饰与日粮诱导两种方法，使模型的组织病理学和病理生理学更接近于动物脂肪肝。例如，对雌性小鼠饲喂含0.0、0.2或2.0%(w/w)胆固醇的HFD 12或24周，结果发现胆固醇喂养的小鼠肝脏胆固醇含量和ALT水平成正比，表明游离胆固醇积累的增加与脂肪肝进展相关，且此混合模型更能模仿人类的脂肪肝状况。通过给8～12周龄和小鼠饲喂MCD日粮(10%脂肪、40%蔗糖、缺乏蛋氨酸和胆碱)，4周后观察到肝脏中的脂肪浸润严重，硫代巴比妥酸反应物水平和亚硝酸盐的增加，且小鼠比和野生型小鼠有明显更高的血清ALT水平和更严重的肝脏炎症和纤维化。由于肝组织的脂肪变性和氧化应激密切相关，这些变化可能促进了动物的NASH。有研究对30周龄OLETF大鼠饲喂含60%果糖的HF日粮，发现其产生了血脂异常和炎症等症状，BiP、p-IRE1α和t-IRE1α蛋白表达量显著增加，表明内质网应激通路被激活。也有研究对小鼠饲喂高铁元素日粮，观察到日粮中的铁超载可以加速动物脂肪肝向NASH的发展进程。

3.3 药物干预模型

药物干预模型是常见的脂肪肝诱导方式之一。大部分药物干预模型可能会导致炎症，但不会导致肥胖。

3.3.1 地塞米松干预模型 地塞米松是一种人工合成的肾上腺皮质激素类药物，具有很强的抗炎和免疫抑制作用，是临床广泛使用的药物，但长期给药有许多副作用，可能会导致肥胖、肝脂肪沉积和血脂异常等不良反应，甚至会出现致命的溃疡伴出血和直肠出血等症状。较早的研究发现，在50～100周龄的白莱航蛋鸡肌肉中注射醋酸地塞米松、黄体酮、皮质酮和促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophic hormone, ACTH)，可降低其采食量、体重、产蛋量和蛋重，增加肝脏重量和卵黄中丙二醛、胆固醇的浓度。也有研究发现每日在大腿肌肉注射4 mg/kg地塞米松磷酸钠连续7 d，或饲喂含地塞米松4 mg/kg日粮12周，可引起24～36周龄蛋鸡氧化应激和脂质过氧化反应。将斑马鱼幼鱼受精5 d后暴露于12.5和25.0 μg/mL地塞米松24 h，可诱导其肝肿大和脂肪变性，是应激诱导肝衰竭的有效模型。

3.3.2 雌二醇干预模型 高水平雌激素与蛋鸡FLHS有关，雌二醇可增加与脂质代谢相关的mRNA表达，上调脂肪酸和三酰基甘油的合成和肝脏脂质的积累。在第1、4、7、10和13天对60周龄海兰白蛋鸡肌肉注射7.5 mg β-雌二醇和0.5 mL/kg玉米油，可显著提高其肝脏总脂含量(<0.05)、肝出血评分和FLHS发生率(<0.05)，并降低产蛋能力(<0.05)。

3.3.3 日粮与药物结合 由于单纯日粮诱导所需时间较长，因此许多动物模型使用了日粮与药物结合诱导的方法。例如有研究对蛋鸡使用地塞米松和HFD混合(51%脂肪、18%粗蛋白和1.5 mg/kg地塞米松)饲喂连续1周，证明了-3脂肪酸对应激状态下蛋鸡肠道形态和营养物质消化率有有益影响，但并不能减轻应激状态对产卵方面的负面影响。

4 体外脂肪肝模型

对于脂肪肝疾病来说，动物模型并不能完全模拟整个疾病发生的病理过程，并且动物模型往往个体差异较大，不同的诱导模型产生的病理状态也有很大区别，为了最大程度上确保试验条件的一致性，肝脏细胞系和原代肝细胞也是体外用来研究脂肪肝疾病的良好模型。体外脂肪肝模型一般将骨髓间充质干细胞培养并分化为肝细胞样细胞，通过药物诱导成脂，以模拟病理环境，此模型可在最大程度确保无关变量一致。有研究者使用脂肪酸如油酸和棕榈油能够模仿高脂日粮所产生的脂肪肝模型，也有对细胞通过基因敲除、药物诱导等方法来模拟脂肪肝，还有研究者使用天然细胞模型模拟动物脂代谢紊乱。

4.1 脂肪酸诱导细胞模型

脂肪酸诱导细胞模型模仿了动物在高脂日粮饲喂的情况，油酸处理可促进HepG2细胞脂滴沉积，显著提高甘油三酯水平(<0.05)，并且油酸介导的人类HepG2细胞反应再现了脂肪肝的许多其他方面，如氧化应激、胰岛素抵抗和炎症因子。也有研究发现对奶牛肝细胞饥饿处理12 h后使用0.25 mmol·L的油酸钠处理9 h可诱导奶牛原代肝细胞脂肪变性，炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平显著升高(<0.05)，表明细胞受到了一定损伤。有研究发现，用油酸和棕榈酸以2:1的比例处理HepG2肝细胞系，会导致过度的脂质积累和炎症细胞因子的上调，包括TNF-α、IL-6和IL-8。

4.2 地塞米松诱导细胞模型

有研究提取3周龄雄性大鼠的骨髓间充质干细胞，使用肝细胞分化培养基持续处理14 d，然后用不同浓度的地塞米松(0、100、500 和 2 500 nmol/L)处理细胞3 d，发现地塞米松抑制miR-122、增加肝细胞YY1的表达，导致了ACE2-MAS1信号通路的抑制，使甘油三酯合成相关基因表达增加，氧化相关基因表达降低，增加了细胞内甘油三酯含量。

4.3 天然细胞模型

研究表明，鸡胚肝脏脂肪从E16开始显著增加，而出壳后整体逐步下降。刚出壳雏鸡分离得到的原代肝细胞含脂量较高，无需额外药物试剂的诱导，是良好的开展体外脂质沉积研究的天然模型，有研究利用此特征，将1日龄雏鸡肝脏分离出原代肝细胞作为肝脏脂代谢紊乱的模型，发现叶酸处理能够显著抑制鸡原代肝细胞中的脂肪酸从头合成，并协同促进甘油三酯的水解和代谢。

5 展 望

肝脏中的脂质积累及其与炎症、氧化应激、细胞死亡和自噬的相互作用是脂肪肝发生的主要原因，然而其确切机制在很大程度上仍是未知的。动物模型为脂肪肝的深入研究提供基础，并为脂肪肝提供了治疗靶点。

目前的动物模型无法完全模拟脂肪肝自然发生的病理过程，不同诱导方式导致基因表达不同，模仿了脂肪肝的不同致病机理与临床症状。表1中对比了多种诱导方式的造模方式、造模周期和典型症状。有研究通过转录组技术进一步比较了日粮、基因和药物3种诱导方式的通路，发现3种诱导方式的共有差异基因很少，但与地塞米松相比，HSHF和db/db代谢相关的共有差异基因相对较多。在试验中需要根据研究目的，选择最合适的方法构建脂肪肝模型，才能相对准确的解析其发病机理，提出最适合的预防和治疗方案，进而提升畜牧产业生产效率。

表1 常见脂肪肝模型对比