藤黄联合卡培他滨治疗肠癌肝转移的活性研究

张 东，祖元刚，熊 彬，魏 亮，张思艳，姜守刚*

(1.东北林业大学，森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040；2.东北林业大学化学化工与资源利用学院，黑龙江哈尔滨 150040)

肠癌(colorectal cancer，CRC)是目前发病率较高的恶性肿瘤之一，由于早期症状不明显，大多数患者确诊后多已处于晚期。肠癌患者术后易发生肿瘤转移，且主要转移部位为肝脏，在后续的治疗过程中，化疗成为主要手段。目前以卡培他滨为基础的三联药物(卡培他滨+奥沙利铂+亚叶酸)是肠癌肝转移疾病治疗时的一线药物，但其毒副作用大，且易耐药，一旦耐药，患者预后极差，因此，急需发展新的高效低毒且不易耐药的药物组合。

藤黄是藤黄科植物藤黄[Hook.f.(clusi-aceae)]树干分泌出的干燥树脂，其主要成分是以藤黄酸为代表的呫吨酮类化合物，为治疗肿毒的临床用药。有研究表明，藤黄作为一种中药可能通过促使肠癌细胞发生G2/M、S期阻滞，调节BAX、Bcl-2和p53蛋白的表达，来达到抗肠癌效果。目前，随着中医药的发展，我国多采用中西医药联合的方法治疗结直肠癌。基于藤黄治疗肠癌具有高效低毒的优势，该试验探讨了藤黄与卡培他滨联合用药对肠癌肝转移的抑制作用。

1 材料与方法

仪器。FA1204B分析天平(济南爱来宝仪器设备有限公司)；ST40R型离心机(上海实维实验仪器技术有限公司)；CX43生物显微镜(南京瞭望光电技术有限公司)；QP-80型二氧化碳细胞培养箱(济南好宝来医疗器材有限公司)；SW-CJ-3F型生物工作台(上海沪净医疗器械有限公司)；Zf11-01型动物饲养柜(东北林业大学植物药工程研究中心设计监制)。

试材。藤黄(亳州仁益中药材销售有限公司)；卡培他滨(CAS号154361-50-9)、AAF固定液(50%)、乌来糖(CAS号 51-79-6)，上海源叶生物科技公司)；RPMI 1640培养基、青霉素-链霉素溶液、胰酶，HyClone公司； DMSO(碧云天生物技术公司)；优级胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；结肠癌CT26.WT细胞(北京协和医院细胞中心)；清洁级BALB/c小鼠(哈尔滨医科大学附属二院动物中心)。

肠癌肝转移模型的建立。将造模所用的BALB/c小鼠随机分组，称重并记录。配制20%乌来糖溶液，以5 mL/kg的麻醉剂量麻醉小鼠。待小鼠进入麻醉状态后，手术部位剃毛，将其放在超净台上。取对数生长期的CT26.WT细胞进行消化、离心，加入适量生理盐水制备成单细胞悬液，用细胞计数板计数细胞，调整细胞浓度为1×10个/mL。采用脾脏种植法向小鼠脾脏内缓慢注入CT26.WT细胞悬液0.l mL，查看无出血后将小鼠脾脏纳回，用可吸收缝合针线全层缝合、包扎，待小鼠经过麻醉时间并恢复意识后，常规饲养。

分组及给药。将4～6周龄、体重20 g左右的雄性BALB/c小鼠随机分为对照组(生理盐水)、藤黄组、卡培他滨组、藤黄联合卡培他滨组，每组6只。造模后第2天开始，对照组和给药组全部采用灌胃的方式连续给药7 d，藤黄组给药剂量为20 mg/kg，卡培他滨组给药剂量为60 mg/kg，联用组药物分别按上述剂量同时给药。

健康状况观察。观察造模前后小鼠的体重变化和生存情况，每3 d称重一次，分析不同药物对小鼠体重的影响，记录小鼠的死亡时间，计算平均生存期，绘制生存曲线。

协同作用测定。待各组小鼠自然死亡后，解剖观察肝脏表面及切面的转移灶及肿瘤结节。由于转移性肿瘤不易从肝脏剥离，称重肝脏也可以间接反映肿瘤的重量，计算肿瘤抑制率，公式如下：抑瘤率=(对照组肝重-给药组肝重)/(对照组肝重-正常组肝重)×100%。

金氏公式是被用来评价联合用药作用强度的公式，公式如下：

在该试验中，、和分别表示藤黄组、卡培他滨组和藤黄联合卡培他滨组对模型小鼠的肿瘤抑制率。当>1.15时，说明藤黄和卡培他滨联用会产生协同作用，当0.85≤≤115时，说明藤黄和卡培他滨分别产生作用，当<0.85时，说明藤黄和卡培他滨联用会产生拮抗作用。

病理学检测 。给药10 d后，每组随机处死1只小鼠，解剖出完整肝脏并用生理盐水清洗，观察各组小鼠肝脏表面结肠癌转移情况并拍照。用4%的多聚甲醛溶液固定取出的小鼠肝脏12 ～14 h，经过脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色、封片等一系列操作后，在显微镜下进行病理观察和分析，判断不同药物对肠癌肝转移的抑制情况。

2 结果与分析

造模后第1天，小鼠进食、进水量明显减少，活动量也减小。术后第3天，小鼠的精神状态开始逐渐恢复。待术后10 d左右小鼠又出现了摄食量减少的现象，并且小鼠腹部开始隆起。术后第15天左右，小鼠开始出现萎靡不振的精神状态，行动缓慢且反应性降低，腹部隆起明显。

建模后，每隔3 d测定并记录小鼠的体重，结果如图1所示。从图1可以看出，各组小鼠的体重在造模后前3 d均出现了减轻的情况，其中藤黄组体重减轻最少。第3天起各组小鼠体重开始逐渐增加，但是给药组小鼠体重的增长速度比对照组缓慢。卡培他滨组小鼠造模前后体重有所降低，而藤黄联合卡培他滨组在造模期间体重变化不显著，表明藤黄联合卡培他滨组的毒副作用明显比卡培他滨组的低。在术后第7天至术后第15天，各组小鼠的平均体重表现出一定的增长，这是因为造模小鼠腹部开始出现血性腹水、体重增加。

图1 模型小鼠的体重变化Fig.1 Weight change in model mice

各组小鼠均采用SPSS 17.0软件中Kaplan-Meier法进行生存期分析，结果如图2所示。结果显示，对照组、藤黄组、卡培他滨组、藤黄联合卡培他滨组的平均生存期分别为(18.00±1.41)、(23.33±3.08)、(27.17±3.66)、(30.83±3.06) d。藤黄联合卡培他滨组与其他各组平均生存期均有显著差异(<0.05)。这表明藤黄联合卡培他滨可以有效延长小鼠的生存期，有较好的抗结肠癌肝转移作用。

图2 模型小鼠的生存期曲线Fig.2 Survival curve of model mice

待模型小鼠自然死亡后解剖，取出完整肝脏，计算各组小鼠的平均肝重，得到给药组的抑瘤率，结果如表1所示。藤黄联合卡培他滨组的平均肝重较藤黄组和卡培他滨组小(< 0.01)。藤黄组、卡培他滨组、藤黄联合卡培他滨组的肿瘤抑制率分别为31.03%、40.52%、63.79%，经过金氏公示测定，得到协同作用结果=1.08，说明藤黄与卡培他滨联合用药没有产生明显的协同作用，但与单一用药相比抑制肠癌肝转移的效果比较显著。

表1 各组小鼠肝脏重量、抑瘤率Table 1 Liver weight and tumor inhibition rate of mice in each group

各组小鼠解剖后的肝脏标本结果如图3所示，与正常小鼠对比，可以观察到模型小鼠的肝脏中都分布了大小不等的灰白色肿瘤结节。对照组肝脏大部分被癌灶所浸润，藤黄组、卡培他滨组的肝脏的肿瘤结节数量远少于对照组，藤黄联合卡培他滨组的肝脏表面仅存在离散的转移结节，并且转移结节数目相对来说较少于其他各组，这表明藤黄与卡培他滨联用具有良好的抗肠癌肝转移作用。

将各组模型小鼠解剖后，对其肝脏进行病理切片分析，结果如图4所示。对照组癌细胞成团且数量较多，说明肿瘤细胞DNA复制剧烈，给药组肝组织中癌细胞团数量呈现不同程度的减少且大小明显减小，癌细胞较疏松，说明药物在一定程度上抑制了肿瘤细胞的转移，其中藤黄联合卡培他滨组肝组织中肿瘤细胞的细胞核与正常肝细胞的细胞核大小相似，抑制肿瘤细胞DNA复制效果最好，即藤黄联合卡培他滨组抗结肠癌肝转移作用最明显。

注：A.对照组；B.藤黄组；C.卡培他滨组；D.藤黄联合卡培他滨组 Note:A.Control group;B.Gambogic group;C.Capecitabine group;D.Gamboge combined with Capecitabine group 图3 模型小鼠肝脏标本Fig.3 Liver samples from model mice

该试验通过BALB/c小鼠脾脏种植CT26.WT细胞建立结肠癌肝转移模型，研究藤黄与卡培他滨联用时对小鼠肠癌肝转移的抑制作用。通过比较对照组和给药组模型小鼠的体重变化、平均生存期、HE染色肝脏病理切片，发现藤黄与卡培他滨联合使用时可以更好地抑制肿瘤细胞的生长和转移，延长生存期。因此，当肠癌肝转移患者使用卡培他滨几个疗程产生耐药后，可以考虑将藤黄与卡培他滨联用，这为治疗肠癌肝转移提供了新的联合给药方法，有望明显延长肠癌肝转移患者的生存期。

注：A.对照组；B.藤黄组；C.卡培他滨组；D.藤黄联合卡培他滨组。图中标有a区域的部分属于正常肝细胞，标有b区域的部分属于肿瘤细胞 Note:A.Control group;B.Gambogic group;C.Capecitabine group;D.Gamboge combined with Capecitabine group图 4 模型小鼠HE染色肝脏病理切片Fig.4 HE-stained liver pathological sections of model mice