大鼠卒中后抑郁模型评价的网状Meta分析*

潘美伯 王 玢 王 慧 刘才艳 任敏洁 董银凤

(南京中医药大学护理学院，南京 210023)

脑卒中(stroke)是严重威胁人类生命健康的重大疾病之一。近年来，其发病率和死亡率在全球范围内不断升高，是我国居民的第三位死亡原因[1]。其中，缺血性脑卒中(ischemic stroke)占三级医院卒中住院患者的81.9%[2]，具有高发病率、高致死率、高致残率及并发症多等特点。卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是脑卒中后最常见的并发症，约1/3的脑卒中患者合并PSD，并明显增加脑卒中的病死率及疾病负担[3]。目前，PSD的病理生理学机制复杂不清，针对PSD的防治尚缺乏明确有效的个体化干预策略。

为了深入研究阐明PSD的病理机制以及干预效果，目前动物实验研究中应用最广泛的大鼠PSD模型主要包括缺血性卒中后进行孤养并给予慢性温和不可预知性应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)及缺血性卒中后孤养联合慢性束缚应激(chronic restraint stress，CRS)两种[4]。各种模型制备方式各有特点，干预时间长短不一，形成抑郁样症状的严重程度不尽相同。选择与PSD的临床病理变化相似、稳定性好、便于操作的大鼠PSD模型对揭示其病理机制及药物评价研究至关重要。网 状Meta分析可通过综合分析比较不同干预措施并对其进行量化统计分析，并根据结局指标的效果进行排序选出最优方案。本研究采用网状Meta分析比较各种PSD模型制备方法的有效性差异，以期为大鼠PSD模型的选择与应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 检索策略

计算机检索维普、万方、知网、Sinomed、Pubmed、WOS、Embase数据库，采用自由词与主题词相结合的方式，检索时限为各数据库建立到2020年8月22日。中文检索关键词为：脑卒中、脑缺血、缺血性脑卒中、大鼠、抑郁、卒中后抑郁、造模方法。英文检索关键词为：stroke，strokes，rat，rats，depress*，animal model。以Pubmed为例，详细检索式见图1。

图1 Pubmed数据库检索策略Fig.1 Retrieval strategy of Pubmed databases

1.1.1纳入标准：①文献研究类型：随机对照试验，不限制盲法的中英文文献；②研究对象：SD大鼠或Winster大鼠；③干预措施：实验组建立卒中后抑郁模型，对照组为缺血性脑卒中组，不限制造模持续时间；④结局指标：体重(body weight，BW)、糖水偏好实验(sucrose preference test，SPT)、旷场实验(open field test，OFT)水平运动评分和旷场实验垂直运动评分，纳入文献的结局指标均可提取。

1.1.2排除标准： ①实验动物不符；②模型制备方法不详；③对照组为非缺血性脑卒中组；④不包含结局指标或结局指标数据不完整；⑤实验设计未采用随机对照试验；⑥重复发表的中英文文献。

1.2 文献筛选及数据提取

文献筛选及数据提取由双人完成：①通过阅读文献标题和摘要排除明显与该文研究不符的文献，剩余文献通过全文阅读根据纳入或排除标准排除文献；②数据提取：先由一名研究者将数据提取并且录入表格中，再由另一名研究者对提取数据核对以确保准确性；③文献筛选和数据提取阶段若有分歧或存在争议交由通讯作者裁决。纳入文献一般资料，包括标题、第一作者、年份、大鼠种属、体重、数量、性别、造模方式、观察结局指标、评价的时间、文献质量等。

1.3 文献质量评价

根据动物实验系统评价研究中心(the Systematic Review Centre for Laboratory Animal Experimentation，SYRCLE)动物实验偏倚风险评估工具(SYRCLE’s risk of bias tool for animal studies)[5]，针对所有纳入文献进行质量评价。SYRCLE工具共包括10个条目，22个亚条目，涉及的偏倚类型包括选择性偏倚、实施偏倚、测量偏倚、失访偏倚、报告偏倚和其他偏倚，适用于动物实验偏倚风险的评估。该评估工具中10个条目的评估结果最终以“Low” “High” 和“Unclear”表示，其中“Low”代表低风险偏倚，“High”代表高风险偏倚，“Unclear”代表不确定风险偏倚。若6项风险偏倚均为低偏倚风险，则文献质量A级；若有一项或以上为中偏倚风险，则记为B级；只要有一项或以上为高偏倚风险，则记为C级[6]。

1.4 统计分析

运用Stata 10.0软件对纳入文献进行网状Meta分析。此次研究结局指标均为计量资料，采用标准化均数差(mean difference，MD)及其95%可信区间(confidence interval，CI)表示，P<0.05表示差异具有统计学意义，并使用等级概率图来表示不同模型的排序。对纳入文献的发表偏倚检验，采用Stata 10.0软件绘制漏斗图。

2 结果

2.1 文献检索及筛选结果

初步检索共2 963篇文献，排除重复文献1 443篇，通过阅读标题和摘要排除文献1 157篇，通过阅读全文排除文献312篇，最终纳入文献51篇，其中英文9篇，中文42篇。筛选流程图见图2，纳入研究的基本资料见表1。

图2 文献筛选流程Fig.2 Flow diagram of literature selection

表1 纳入研究的基本特征Table 1 Basic Characteristics of Included Studies

2.2 纳入文献的基本特征

纳入51项研究皆为随机对照试验(表1)，共998只大鼠。其中，47.06%的研究干预周期为21 d(n=24)，采用CUMS造模的研究42项，共809只大鼠；采用CRS造模的研究共9项，共199只大鼠。在51项卒中后抑郁模型研究的网状关系(图3)中，点与点间连线说明CUMS组与卒中组之间、CRS组与卒中组之间有直接比较关系；CUMS组与CRS组间尚无直接比较的研究，可采用间接比较进行网状关联分析比较，线条越宽表示两个干预措施对比研究频次越多。其他造模方式未提取到数据，因此未纳入本研究。

图3 纳入文献之间网状关系Fig.3 Mesh relationship of included studies

2.3 文献质量评价及偏倚风险评价

纳入51项研究均为随机对照试验，文献的基本特征见表2，其中96.08%的文献评价为B级(n=49)，3.92%文献评价为A级(n=2)；4个及以上条目评价为“低风险”的文献数量大于70%(n=37)，且均不存在选择性结果报告或其他偏倚。76.47%的研究报道了基线均衡(n=39)，62.75%的研究对结果的完整性有所说明(n=32)，报道随机安置的研究为54.9%(n=28)。仅有7.84%的研究描述具体的随机方法(n=4)，所有研究均未报道是否分配隐藏、动物饲养者的盲法是否被打破及评估时是否随机抓取动物，仅有25.49%的研究报道了结果测评者的盲法(n=13)。由于动物实验与人体实验的方法学差异，基线均衡时未进行分配隐藏不会产生严重的选择性偏倚，对饲养者未采用盲法、结果测评时是否随机抓取不影响其客观结局指标的测定，产生高风险测量偏倚的可能性较小。漏斗图显示大部分文献聚拢在漏斗底部(图4)，左右分布基本对称，说明纳入文献偏倚较小。

表2 文献质量评价结果Table 2 Quality evaluation results of studies

图4 纳入文献之间偏倚的漏斗图Fig.4 Funnel plot of bias for included studies

2.4 结局指标的网状Meta分析结果

2.4.1体重：纳入的研究中有26项研究报告了体重，以MD为效应量，95% CI作分析统计，两种造模方式分别与卒中组作比较，CUMS组14 d【MD=-1.20(-1.69,-0.70)，P<0.05】、21 d【MD=-1.82(-2.29,-1.34)，P<0.05】、28 d【MD=-2.12(-3.49,-0.75)，P<0.05】, 束缚组14 d【MD=-2.96(-4.98,-0.94)，P<0.05】、21 d【MD=-3.11(-4.59,-1.64)，P<0.05】、28 d【MD=-3.29(-5.97,-0.61)，P<0.05】。与缺血性脑卒中组相比，CUMS组和CRS组均自干预后14 d开始至干预后21 d和28 d出现体重的显著降低，且CRS组大鼠体重降低较CUMS组更加明显，但两组间比较差异不显著(表3)。

2.4.2糖水偏好：纳入的研究中共有47项研究报告了糖水偏好数据，两种造模方式分别与卒中组作比较，CUMS组7 d【MD=-1.62(-2.39,-0.85)，P<0.05】、14 d【MD=-2.27(-2.78,-1.76)，P<0.05】、21 d【MD=-18.76(-23.63,-13.88)，P<0.05】、28 d【MD=-3.78(-5.68,-1.88)，P<0.05】, 束缚组14 d【MD=-2.96(-4.98,-0.94)，P<0.05】。与缺血性脑卒中组相比较，CUMS组分别在干预后7、14、21、28 d 出现糖水偏好率的显著降低，而CRS组仅在干预后14 d的糖水偏好率显著低于缺血性脑卒中组；CUMS组和CRS组相比较，其糖水偏好率在各时间点的变化差异均无统计学意义(P>0.05，表3)。

2.4.3旷场实验水平运动评分：纳入的研究中共有47项研究报告了旷场实验水平运动数据，CUMS组7 d【MD=-1.62(-2.58,-0.66)，P<0.05】、14 d【MD=-2.64(-3.79,-1.48)，P<0.05】、21 d【MD=-3.66(-4.46,-2.86)，P<0.05】、28 d【MD=-2.11(-2.87,-1.34)，P<0.05】，束缚组28 d【MD=-2.24(-3.54,-0.95)，P<0.05】。与缺血性脑卒中组相比较，CUMS组分别在干预后7、14、21、28 d 出现旷场实验水平运动评分的显著降低，而CRS组仅在干预后21、28 d的旷场实验水平运动评分显著低于缺血性脑卒中组；CUMS组和CRS组相比较，其旷场实验水平运动评分在各时间点的变化差异均无统计学意义(P>0.05，表3)。

表3 网状Meta分析结果Table 3 Results of network Meta-analysis

2.4.4旷场实验垂直运动评分：纳入的研究中共有47项研究报告了旷场试验垂直运动数据，CUMS组7 d【MD=-0.77(-1.23,-0.33)，P<0.05】、14 d【MD=-2.07(-2.81,-1.34)，P<0.05】、21 d【MD=-3.15(-4.15,-2.15)，P<0.05】、28 d【MD=-1.96(-2.65,-1.26)，P<0.05】，束缚组14 d【MD=-1.72(-2.92,-0.52)，P<0.05】、21 d【MD=-3.65(-5.80,-1.51)，P<0.05】、28 d【MD=-1.63(-2.68,-0.58)，P<0.05】。与缺血性脑卒中组相比较，CUMS组分别在干预后7、14、21、28 d 出现旷场实验垂直运动评分的显著降低，而CRS组仅在干预后14、21、28 d的旷场实验垂直运动评分显著低于缺血性脑卒中组；CUMS组和CRS组相比较，其旷场实验垂直运动评分在各时间点的变化差异均无统计学意义(P>0.05，表3)。

2.4.5结局指标的概率排序：为了比较两种造模方式的可靠性，对不同干预方式的结局指标进行概率排序。其中体重、糖水偏好、旷场实验水平运动评分、旷场实验垂直运动评分均以Rank 100%为概率排序最佳，数值越大说明此种造模方式在该指标上越可靠(表4)。如以体重第7天测量为例，CRS组排名第1的概率为94.5%。由表4可知，体重指标上有效性的排序为：CRS型>CUMS型；在糖水偏好指标上从高到低的排序为：CUMS型>CRS型；在旷场实验水平及垂直评分中两种造模方式有效性在不同时间各有不同。

表4 各造模方式概率排序Table 4 Ranking list of different treatment

3 讨论

卒中后抑郁影响脑卒中的预后及生存质量，其病因和病理生理机制改变尚未完全明确[57]，当前临床治疗中存在药物起效慢、治疗周期长、副作用大等问题[58]。选用较为理想的卒中后抑郁的动物模型，不仅有利于阐明卒中后抑郁的病理生理机制及评价药物治疗效果，而且有利于提高实验的可重复性及向临床的有效转化。当前关于卒中后抑郁的相关基础研究中，采用的动物模型均为卒中联合孤养后复合抑郁造模，如CUMS型、CRS型、悬尾联合强迫游泳型、利血平或内皮素药物注射型、中医郁症模型等，其中以CUMS型和CRS型应用最广泛[59-60]。由于基于不同理论依据的两种造模方式各有优劣，未形成统一标准。

CUMS是指长时间随机对实验动物使用包括但不限于禁食和禁水、昼夜颠倒、湿垫层、笼倾斜、压力、强迫游泳和束缚等一系列应激操作[61]。CUMS模型的理论依据是临床患者遭遇卒中后经历大量不可预知的负性生活事件，其所致的疾病发生和表现形式更能模拟人类的抑郁症状及由此引起的生化改变。该模型动物的情绪表现与人类相应情绪表现相似；产生情绪障碍的生物学机制与人类相同；对于情绪障碍有效药物有明显的反应性，即符合情绪障碍动物模型的评价标准，因此被广泛使用在抑郁症状研究领域[62]。兴趣缺失或快感缺乏是抑郁症的核心症状，在动物实验中，通常应用糖水偏好实验评价动物的快感缺乏[63]。此外，基于抑郁症患者对社会的参与度下降，大量研究也证实抑郁模型大鼠表现为运动量减少及回避行为产生[12]。旷场实验是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法[64]，常用运动评分来检测其焦虑、抑郁程度。本研究发现，CUMS在任一检测时间点使大鼠糖水偏好明显减弱，旷场运动水平运动及垂直运动评分降低，这种变化趋势产生相较于CRS更早。可能的原因包括：CUMS干扰昼夜节律从而引起大鼠抑郁相关激素分泌改变[65]，不舒适的笼具环境刺激导致其产生回避型为等。也有研究认为，CUMS造模7-14 d内大鼠糖水偏好及旷场运动评分降低更可能是焦虑样行为的表现[66]。CUMS模型的不足之处在于适用动物品系有一定的局限性，对实验设备的要求高，操作复杂，工作量较大，造模周期较长，造模过程中动物死亡率较高等问题。

CRS是指长时间以剥夺身体自由、束缚制动为应激源的动物模型[67]，束缚期间禁食、禁水。该模型符合由急性转入慢性的发展趋势，利于动物整体评价。其理论依据是临床卒中患者遭遇卒中后陷入社会隔离状态[68]、脑区受损导致肢体活动障碍及一定程度的吞咽障碍[69]，进而导致日常活动能力下降，体重减轻，从而引起卒中后抑郁，可用于PSD相关研究。本研究结果显示，干预14 d后两组较卒中组均出现体重的显著降低，以CRS组降低最明显。CRS组每日进行束缚应激时肢体活动受限，禁食水一定时间，束缚期间排泄于笼具内，形成潮湿环境，产生刺激性气味，与CUMS模型中多种刺激类型相同，且由于身体的束缚应激，因此对大鼠体重影响更大[70]。临床研究表明，脑卒中患者卒中后肌力下降、吞咽障碍、自理能力下降、生活质量降低是卒中后抑郁形成的重要危险因素[71-72]。由此可见，在PSD模型体重降低的有效性上CRS模型优于CUMS模型。CRS 的优点是应激类型更贴合临床实际，应激因子单一，制作方式较为简单，工作量小，造模期间动物死亡率低；不足之处是由于对单一应激动物容易产生适应，抑郁症状可能出现较慢或自发改善。最新的研究提出了一种改进的CRS方式，用多次间断束缚应激代替单一长时间束缚应激，在束缚总时长相同的情况下，间断束缚更容易引起啮齿动物抑郁样表现，干预第5周时，间断束缚组小鼠体重明显低于持续束缚组[73]。

虽然本研究纳入了足够数量的文献，但异质性较大，结局指标偏多不便进行敏感性检验，可能存在一定的偏倚风险，下结论时需更加谨慎。所纳入指标的测量单位不同，尽管用随机效应模型进行统计，但仍存在一定的局限性。此外，对于大鼠的性别、初始体重等对造模后的体重以及行为学影响较大的因素，由于部分文章未报道基线，不便进行差值计算后进行统计分析，削弱了本研究的严谨性。由于无法提取足够的数据，其他卒中后抑郁造模方式也并未纳入本文研究。

综上所述，本研究结果表明CUMS与CRS两种方式均能形成PSD模型，模型效果的结局指标并无统计学差异，但CUMS模型大鼠在糖水偏好实验和旷场实验中抑郁样行为表现出现时间更早、更稳定，而CRS模型对大鼠的体重影响更明显。尽管两种模型的有效造模时长相近，但CRS在模拟临床实际、造模成本大小、造模死亡率高低及工作量大小上可能较CUMS更具优势。由于此次研究纳入的文献量有一定的局限，证据力度仍有待加强。因此，今后仍需扩大样本量，纳入更多高质量的相关研究，进一步对研究结论的可靠性予以证实。