基于水蒸气蒸馏法的狮头柑精油提取工艺优化及成分分析

宋 雪，王增斌，包俊文，庞同汇，鲁周民

（西北农林科技大学林学院，陕西杨凌 712100）

植物精油是从植物的花、叶、果实等部位提取的一类次生代谢产物[1]。研究表明植物精油具有抑菌[2]、消炎[3]、抗氧化[4]、减肥[5]、镇痛[6]、抗癌[7]、杀虫[8]、改善高胆固醇血症和肝脂肪变性[9]等作用。植物精油提取及应用已成为目前研究的热点。精油的提取方法有压榨法[10]、水蒸气蒸馏法[11]、有机溶剂萃取法[12]、超临界CO2萃取法[13]及亚临界流体萃取法[14]等。压榨法操作周期长、出油率低，有机溶剂萃取法虽然提取率较高、但有机溶剂与精油难分离，超临界CO2萃取法及亚临界流体萃取法成本高。水蒸气蒸馏法具有成本低、水油易分离、简便无污染等优点，广泛用于橘皮[15]、肉桂[16]、玫瑰[17]等植物精油提取。狮头柑（Citrus reticulataBlanco cv. Manau Gan）属于芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus），为陕西安康特有经济林果树[18]。狮头柑因果面粗糙，形似狮子头而得名[19]，其果实个大、皮肉不粘连易剥离，果肉汁多渣少、酸甜适中、后味微苦，具有清热解毒、降火明目、止咳生津等多种保健作用。据西北农林科技大学农科院校区测试中心对狮头柑果实检测报告显示，狮头柑果实含蛋白质0.95%，VC0.12 mg/100 g，含钙（Ca）147.4 mg/kg，含磷（P）166.9 mg/kg，含铁（Fe）2.31 mg/kg，未检出砷、铅、汞等12 种有毒物质，具有很高的营养价值[20]。前期研究表明，狮头柑具有和其他柑橘完全不同的香味[21]。目前，有关狮头柑研究报道主要有以狮头柑皮为原料的果酱加工工艺[22]，超声辅助有机溶剂萃取狮头柑精油[23]，狮头柑果皮总黄酮提取工艺优化[24]，狮头柑籽油的提取工艺优化及脂肪酸组分分析[25]等，水蒸气蒸馏法提取狮头柑精油鲜见报道。本研究以狮头柑果皮鲜样为原料，首先对水蒸气蒸馏设备进行优选，在单因素实验的基础上对水蒸气蒸馏工艺进行响应面优化，并对精油成分进行分析，旨在为狮头柑及其他柑橘果皮精油的提取与利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

狮头柑 采摘自西北农林科技大学安康北亚热带经济林果树试验示范站；液氮 杨凌液氮服务配送中心。

BCD-215DC 型冰箱 中国海尔集团；R200D型电子分析天平 精度0.0001，德国Sartorious 公司；KH-500DE 型数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；1310GC-MS 联用仪（四极杆质量分析器，电子电离源和化学电离源） 美国赛默飞世尔科技有限公司；佳声800C 多功能粉碎机 永康市红太阳机电有限公司；1.5 L 蒸馏锅 丽水市玖亚商贸有限公司；可调式电热套 北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 狮头柑鲜果皮样品的制备 选用果形饱满、成熟度一致、无病虫害和机械损伤的狮头柑，其鲜果皮经多功能粉碎机加液氮冷冻研磨一定时间得到果皮样品。

1.2.2 狮头柑鲜果皮精油的制备 采用水蒸气蒸馏法[26]提取精油，取果皮样于500 mL 蒸馏瓶中，加入一定比例蒸馏水并进行超声辅助处理后，加入两粒沸石进行蒸馏提取一定时间，收集精油并称量，计算得率Y，每个处理3次重复。计算公式为：

式中：Y 表示精油得率，%；M1为提取后精油的质量，g；M2为经过处理之后的狮头柑样品质量，g。

1.2.3 水蒸气蒸馏提取设备优选 准确称取30 g 狮头柑果皮样品4 份，按照料液比1:8（g/mL）加入蒸馏水于烧瓶中，在超声功率80 W、超声温度40 ℃、超声处理30 min，分别使用如图1所示的4 种水蒸气蒸馏设备蒸馏提取2 h，称量精油质量，计算得率Y。

图1 4 种不同的水蒸气设备Fig.1 Four different steam equipment

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 研磨时间对狮头柑精油得率的影响 固定料液比1:8（g/mL）、超声功率80 W、超声温度40 ℃、超声处理30 min、蒸馏时间2 h，分别考察狮头柑鲜果皮样品经冷冻研磨10、15、20、25、30 s 后对精油得率的影响，按照1.2.2 工艺流程制备狮头柑鲜果皮精油，并计算得率Y。

1.2.4.2 料液比对狮头柑精油得率的影响 固定冷冻研磨25 s、超声功率80 W、超声温度40 ℃、超声处理30 min、蒸馏时间2 h，分别考察料液比1:6、1:7、1:8、1:9、1:10（g/mL）对精油得率的影响，按照1.2.2 工艺流程制备狮头柑鲜果皮精油，并计算得率Y。

1.2.4.3 蒸馏时间对狮头柑精油得率的影响 固定冷冻研磨25 s、料液比1:8 （g/mL）、超声功率80 W、超声温度40 ℃、超声处理30 min，分别考察蒸馏时间1、1.5、2、2.5、3 h 对精油得率的影响，按照1.2.2工艺流程制备狮头柑鲜果皮精油，并计算得率Y。

1.2.4.4 超声温度对狮头柑精油得率的影响 固定冷冻研磨25 s、料液比1:8（g/mL）、超声功率80 W、超声处理30 min、蒸馏时间2 h，分别考察超声温度20、30、40、50、60 ℃对精油得率的影响，按照1.2.2工艺流程制备狮头柑鲜果皮精油，并计算得率Y。

1.2.4.5 超声功率对狮头柑精油得率的影响 固定冷冻研磨25 s、料液比1:8 （g/mL）、超声温度40 ℃、超声处理30 min、蒸馏时间2 h，分别考察超声功率60、70、80、90、100 W 对精油得率的影响，按照1.2.2工艺流程制备狮头柑鲜果皮精油，并计算得率Y。

1.2.4.6 超声时间对狮头柑精油得率的影响 固定冷冻研磨25 s、料液比1:8 （g/mL）、超声功率80 W、超声温度40 ℃、超声处理30 min、蒸馏时间2 h，分别考察超声时间10、20、30、40、50 min 对精油得率的影响，按照1.2.2工艺流程制备狮头柑鲜果皮精油，并计算得率Y。

1.2.5 响应面优化试验 在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken 试验设计对超声温度、超声功率和超声时间3 因素进行响应面优化设计。试验设计见表1。

表1 狮头柑精油提取试验因素水平设计Table 1 Factors level of essential oil extraction test of Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

1.2.6 狮头柑鲜果皮精油成分测定 将提取的狮头柑精油用正己烷稀释1000 倍后，吸取1 mL 加入进样瓶中进行GC-MS 分析[27]。

气相色谱条件：色谱柱：TG-5MS 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升温，初始柱温为50 ℃，保持1 min，以3.0 ℃/min 升温至130 ℃，保持1 min，以2 ℃/min 升温至150 ℃，保留1 min，以10 ℃/min 升温至280 ℃，保持5 min，载气为高纯氦气，流速1.000 mL/min，进样口温度250 ℃，进样量0.2 μL，分流比40:1。

质谱条件：离子源为EI，电子能量70 eV，接口和离子源的温度分别为280 和270 ℃，扫描范围：40～460 aum。

1.3 数据处理

利用Excel 对数据进行分析与统计；采用Origin 2021 b 进行制图；SPSS 25.0 进行单因素方差分析；Design-Expert V 10.0.1 进行响应面试验设计；所得质谱图运用计算机Xcalibur 系统NIST2014 谱库自动检索，仅报道SI 和RSI 均大于800 的鉴定结果，面积归一化法计算各组分相对含量；数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 水蒸气提取设备选择结果

4 种水蒸气蒸馏设备提取狮头柑精油结果如图2所示。由图2可知，所选4 种水蒸气蒸馏设备提取精油的得率由高及低依次为：II（Clevenger 挥发油蒸馏仪）＞III（恒压萃取水油分离器）＞I（普通水蒸气设备）＞IV（蒸馏锅提取设备）。普通水蒸气蒸馏设备和蒸馏锅提取设备在蒸馏过程中提取物一直暴露在外界空气中，精油挥发较多，而恒压萃取水油分离器的提取物处于较为密闭的环境，但三者收集到的精油均需要通过分液漏斗进行进一步分离，在此过程会造成精油损失；Clevenger 挥发油蒸馏仪具有密闭性好，蒸馏过程中自动进行水油分离的优点，并且价格较其他设备更有优势，故选用Clevenger 挥发油蒸馏仪作为后续试验的提取设备。

图2 不同水蒸气设备对狮头柑精油得率的影响Fig.2 Effects of different steam equipment on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2 单因素实验结果

2.2.1 研磨时间对狮头柑精油得率的影响 随着狮头柑研磨时间的增加，狮头柑精油得率呈先上升后下降趋势，在25 s 处达最大值2.03%±0.02%，如图3所示。研磨时间太短，物料粒径过大，表面油囊未破坏完全，挥发油未能充分释放，导致得率低；当研磨时间不断增长，根据扩散定律[28]，粉碎度越高，粒径越小，与水蒸气接触面积越大，越有助于挥发油提取，狮头柑得率就越高；但当物料颗粒度过细，颗粒容易吸附一部分精油，挥发油阻力增大，使得率降低。因此选择研磨时间25 s。

图3 研磨时间对狮头柑精油得率的影响Fig.3 Effect of grinding time on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2.2 料液比对狮头柑精油得率的影响 随着料液比的增加，狮头柑精油得率呈现先上升后下降趋势，当料液比达到1:8（g/mL）时精油得率达到最大为2.27%±0.03%，当料液比超过1:8（g/mL）时精油得率不断降低趋于平衡，如图4所示。加水量较低，狮头柑样品不能充分和溶剂结合，得率低，并容易导致糊化。随着料液比增加，物料与水充分融合，接触面积加大，扩散速度提高，得率也相应提高。当料液比过大时，虽然挥发油充分释放，但总量不再增加，在水中溶解度也相应提高，于溶剂中损失的量增加，故最终的挥发油得率降低[29]。因此料液比选取1:8 （g/mL）。

图4 料液比对狮头柑精油得率的影响Fig.4 Influence of solid-liquid ratio on extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2.3 蒸馏时间对狮头柑精油得率的影响 狮头柑精油得率随蒸馏时间呈先上升后缓慢下降趋势，在蒸馏时间2.5 h 时精油得率高达2.32%±0.03%，如图5所示。蒸馏2.5 h 能够使狮头柑果皮中的精油最大限度的提取出来，精油基本提取完成。提取时间过长，精油得率稍微有所下降，是因为长时间的提取，造成精油中部分化学性质发生变化破坏，导致得率降低[30]。因此蒸馏时间选取2.5 h。

图5 蒸馏时间对狮头柑精油得率的影响Fig.5 Effect of distill time on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2.4 超声温度对狮头柑精油得率的影响 狮头柑精油得率随超声温度的增加呈先上升后下降的趋势，如图6所示，由于狮头柑精油的溶出需要一定的温度条件，温度上升可加快分子运动，动能增大，狮头柑精油得率呈现上升趋势，在30 ℃达到最大值2.26%±0.03%。在30 ℃之后，得率呈现下降状态，原因是高温导致狮头柑精油成分降解、热敏性物质的氧化[31]。

图6 超声温度对狮头柑精油得率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2.5 超声功率对狮头柑精油得率的影响 图7 为超声功率对狮头柑精油得率的影响，狮头柑精油得率随超声功率的增加呈现先增加后降低的趋势，在超声功率达到80 W 时得率达到最大值2.46%±0.03%。其原因可能是超声波的空化作用形成高温高压环境，增加水分子穿透力，加速精油进入水蒸气中，提高精油得率[32]；随着超声波功率的增大，对细胞壁的破碎作用增强，破坏细胞类物质结构[33]；较高的超声波直接导致精油的分解，导致得率降低[34]；另一方面，超声波的除气效果可能是造成部分精油的流失。

图7 超声功率对狮头柑精油得率的影响Fig.7 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2.6 超声时间对狮头柑精油得率的影响 随着超声时间的延长，狮头柑精油的得率呈现先上升后下降趋势，在30 min 时达到最大，为2.36%±0.03%。如图8所示，当超声时间在10～30 min 时，精油得率随时间延长呈上升趋势，这可能是因为超声波的作用加剧了细胞破碎度，利于狮头柑精油在溶剂中的溶出，提高了得率[35]。在超声时间超过30 min 后，得率呈现下降状态，可能是因为超声时间增加，热敏性提高，导致狮头柑精油中的某些物质分解和挥发，也可能由于物料中一些水溶性杂质溶解于水中，增加了提取溶液的浓度，降低了精油在蒸汽中的得率，使得精油得率降低[36]。

图8 超声时间对狮头柑精油得率的影响Fig.8 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.3 响应面优化结果

2.3.1 响应面试验设计及结果 综合单因素实验结果，考虑到超声辅助处理对狮头柑精油的提取有较大影响，因此固定研磨时间、料液比和蒸馏时间，选择超声温度（A）、超声功率（B）和超声时间（C）三个因素，狮头柑精油得率（Y）为响应值，采用Box-Behnken中心组合试验原理设计三因素三水平试验优化狮头柑精油提取条件。响应面试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface test design and results

2.3.2 回归模型的建立与分析 应用Design-Expert V 10.0.1 软件对表2 中的狮头柑精油得率Y 结果进行响应面回归拟合分析，所建立的二次回归模型为：

Y=2.47+0.11A+0.15B+0.047C+0.030AB-0.010AC+0.070BC-0.16A2-0.22B2-0.17C2，对此模型进行显著性分析，结果见表3。

表3 回归模型显著性分析结果Table 3 Significance analysis results of regression model

由表3可知，回归模型的F值为98.28，P值＜0.01，表明模型显著，失拟项P值=0.2291＞0.05，没有显著差异，说明该模型与试验结果拟合程度良好。该模型决定系数R2=0.9921，剔除二次项中不显著项，将拟合方程修正为：Y=2.47+0.11A+0.15B+0.047C+0.070BC-0.16A2-0.22B2-0.17C2，调整后决定系数R2Adj为0.9871，大于0.80，进一步证明该模型与试验结果拟合程度较好，变异系数CV=1.52%，说明预测值与试验值相关性较好，试验误差较小，可用来对狮头柑精油提取工艺进行分析和预测。

F值大小可以判断各因素对试验指标的重要程度，F值越大，说明此因素对狮头柑精油得率的影响越大，通过表3 可以看出狮头柑精油得率受3 种因素影响大小顺序为：B＞A＞C，即超声功率＞超声温度＞超声时间。根据试验结果可知，模型中A、B、A2、B2、C2对得率的影响极显著（P＜0.001），C、BC 为高度显著（P＜0.01），其余项对狮头柑精油影响不显著。

2.3.3 响应面试验图形分析 利用软件Design-Expert V 10.0.1 模拟得到各因素交互作用对狮头柑精油得率的三维响应面和等高线，通过三维响应面图和等高线图分析各因素之间交互作用的强弱。如图9a 三维响应面图，发现开口为向下的曲面图，形如山丘一样中间拱起，而四周相对较低的曲面，代表存在极大值，表明超声功率与超声时间两因素交互作用对响应值的影响较强，两者组合对狮头柑精油得率影响较显著。在等高线图中，最小圆的中心响应值最大，圆形表示因素之间交互作用较弱，椭圆形表示因素之间交互作用较强，由图9b 可以看出，超声功率B 与超声时间C 两因素的交互作用对狮头柑精油得率影响的等高线图呈椭圆形，表明两者组合对狮头柑精油得率影响较强，这与2.3.1 中显著性分析结果相一致。

图9 各因素间交互作用对狮头柑精油得率的响应面及等高线图Fig.9 Response surface and contour diagram of interaction between various factors on the extraction rate of essential oil of Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.3.4 最优工艺参数确定及验证 通过Design-Expert V 10.0.1 软件，并结合回归模型和响应面图分析得出狮头柑精油得率的最佳工艺条件为：超声温度33.382 ℃、超声功率83.752 W、超声时间32.230 min，在该条件下模型预测狮头柑精油得率为：2.517%±0.013%。为方便实际试验操作，将最佳工艺条件修正为：超声温度33 ℃、超声功率为80 W、超声时间32 min，在此条件下重复验证3次所得到的狮头柑精油的得率为2.50%±0.02%，与预测值十分接近，说明此二次多项式回归方程对狮头柑精油得率的预测是可靠的，具有一定的实际指导意义。

2.4 水蒸气蒸馏法提取狮头柑精油的成分分析

利用GC-MS 方法分析狮头柑精油成分，总离子色谱图如图10所示。所得质谱图运用计算机Xcalibur 系统NIST2014 谱库自动检索，并结合文献报道的已知化合物确认检测物成分后，初步确认了29 种化学成分（表4）。

表4 狮头柑精油GC-MS 分析结果Table 4 GC-MS analysis results of essential oil of Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

续表 4

图10 狮头柑精油成分总离子流Fig.10 Total ion flow of essential oil components of Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

水蒸气蒸馏法提取的狮头柑精油中共鉴定出29 种相对含量较多的组分，共占气相出峰总萃取物的99.16%。主要成分为烯烃类97.75%，主要有D-柠檬烯（88.35%），这与林梦雅[37]文中提到的柑橘皮中含有32%～98%的柠檬烯所吻合，其次是萜品烯（6.23%）、á-月桂烯（1.63%）、蒎烯（1.21%）这与王会全等[26]研究成果D-柠檬烯（84.22%）、萜品烯（6.55%）、月桂烯（1.67%）、α-蒎烯（1.13%）萜类化合物为柑橘皮精油的主要成分大体上吻合；除此之外还有少量的醇类0.27%，醛类0.26%等单萜类物质。特别地，2,2'-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）一般出现在玫瑰精油中[38-43]，这很可能是狮头柑拥有不同于其他柑橘气味的原因，有待进一步研究。

3 结论

对4 种水蒸气蒸馏提取设备优选结果表明，Clevenger 挥发油蒸馏仪是狮头柑精油的最佳水蒸气提取设备；狮头柑精油提取的最佳工艺为：粉碎时间25 s、料液比1:8 （g/mL）、超声温度33 ℃、超声功率80 W、超声时间32 min、蒸馏提取2.5 h，此条件下狮头柑精油得率可达到2.50%±0.02%。通过气相色谱-质谱法（GC-MS）对狮头柑精油进行成分分析，主要包括烯烃类、醇类、醛类等，共鉴定出 29 种化合物，占总萃取物的99.16%，其中以D-柠檬烯相对含量最高，达到88.35%，萜品烯6.23%、á-月桂烯1.63%等。本研究对常用水蒸气蒸馏提取设备进行提取效果比较，为水蒸气蒸馏提取设备选择方面提供理论参考；研究优化的精油提取工艺可用于狮头柑精油提取生产，具有较好的提取效果，同时为其他柑橘类精油提取提供理论指导。