药品中需氧菌总数能力验证不满意结果的OOS分析

王立云 杨晓云 牛萌萌 姬俊

（青岛市食品药品检验研究院/国家药品监督管理局海洋中药质量研究与评价重点实验室 山东 青岛 266071）

1 前言

出具准确可靠的检测数据，不断提升检测能力是实验室运行的基础[1]，加强内部质量控制，参与外部能力验证是评价实验室检测能力的重要手段[2]，能够帮助实验室识别风险。

本实验室参与2021年度药品需氧菌总数的能力验证，在3个样品中出现1个不满意结果（样品1），2个满意结果（样品2、3），按照实验室认可质量体系的要求，对不满意结果的纠正与预防措施（Corrective Action and Protective Action，CAPA）立即全过程启动[3]，本文对此进行分析。

2 处理过程

2.1 启动《不符合检验工作控制程序》

本实验室立即启动《不符合检验工作控制程序》，填写《不符合工作处理单》，终止该项目的检验工作，并及时向质量控制部门报告情况，申请进一步识别并获准停止该项工作的正式许可，分析不满意结果产生的根本原因，梳理近半年的检验报告和原始记录，提出纠正措施并实施[4-5]。

2.2 原因分析

按照《中国药典》2020版中“9203药品微生物实验室质量管理指导原则”，从人员、样品、设施环境等因素进行逐一排查，最终确定引起不满意结果的原因。

（1）人员。3名检验人员均经过上岗培训并取得资格证，有多年微生物检验工作经验。本次实验有3批样品，每人分别负责1批样品的开启、溶解，并制备待测溶液，同时进行3份样品的稀释、加培养基等操作，因3人的计数结果一致，故初步排除人员的问题。

（2）培养基。该试验采用本实验室常用的国内A厂家的TSA成品培养基，在购入后曾进行验收，结果为合格，且密闭储存于设有除湿机的房间，实验前现配，灭菌后调节pH。采用中检院的胰酪大豆胨琼脂对照培养基（用于需氧菌总数计数适用性检查或检验）作为比对培养基，结果与A厂家培养基一致，由结果报告可知，试验分到的样品中2份为同批次样品，1份结果满意，1份结果不满意，故可排除培养基的问题。

（3）试剂。该试验采用国内A厂家生产的pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液，每瓶500 mL，临用现开。

（4）菌种。该试验未做阳性对照，所用的TSA培养基为日常备用，曾多次验证（加标回收），均符合《中国药典》2020年版的要求，最近一次使用距离该实验未超过10 d，以空白培养基为阴性对照。

（5）设备。该试验所用培养箱为INE-500型培养箱，2021年3月1日由青岛市计量院进行检定及校正，试验前用外置温度计对数显屏幕上的温度进行核对，故可排除培养条件的问题。

（6）设施和环境条件。由结果报告可知，为考察实验室在检验过程中是否由于环境设施、操作等污染样品，故样品3中未添加菌种，本实验室检测样品3无菌，为满意结果，可以反证设施及环境条件符合要求。

（7）样品及检验方法。该试验样品为3瓶分别置于安瓿瓶中的乳白色冷冻干燥物，收到样品后第一时间置于-20℃度冰箱中保存，检测前将样品平衡至室温。制备待测溶液时，为避免转移损失，未进行转移操作，直接向安瓿瓶中加入10 mL pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液，充分混匀后完全溶解成乳白色均一溶液，作为待测供试品（10 mL）；按作业指导书中“室温放置15 min”（为细菌能够充分复苏），再次混匀，进行10倍稀释，取待测液1 mL置于9 mL pH 7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液中；分别取待测供试液原液、1∶10液、1∶100液1 mL置于培养皿中，加入配置好的温度低于45℃的TSA培养基，混匀，静置；待培养基凝固后置于32.5℃培养箱中培养，每日点计。该试验过程较简单，偏差不应来源于此。

（8）结果计算及报告。该试验有2处易被忽视的细节：未注意作业指导书中对待测溶液的规定，误认为第一步稀释的溶液是1∶10溶液，而将上报结果扩大了10倍，即cfu/g，实际应为cfu/mL；数据上报应取菌落数小于300的稀释级别[6]，计算后取2位有效数字。

由结果报告可知，样品1和2为同批样品，添加约103～104cfu的微生物。在统计本次能力验证结果时，该样品的结果中位值为1 500；在考察样品均匀性和稳定性时，该样品的含菌量约为1 000，本实验室的结果偏低，样品3中未添加微生物，结果见表1。

表1 能力验证结果

进一步分析原始数据（见表2），样品1、2由原液到1∶1 000的10倍稀释液中计数存在异常，前者含菌量明显偏低，未成梯度趋势。此时按照药典中取平均最高菌落数计算后的数值上报，结果与实际含菌量不符。在1∶100稀释级得到的结果是样品1、2中均含有1 400、1 500cfu/mL的微生物，说明样品中的含菌量达到1 000以上，原液或1∶10溶液得到的结果偏低，应是菌落未长出或未被计数。若高稀释度平板上的菌落数更高，则说明检验过程出现差错或样品中含抑菌物质，不满意结果的原因应在于此。

表2 能力验证原始数据

该试验样品中添加的微生物包含金黄色葡萄球菌（CMCC（B）26003）、（CMCC 63303）和白色念珠菌（CMCC（F）98001）。蜡样芽孢杆菌的菌落较大，表面粗糙、扁平、不规则，在普通琼脂平板培养基上37℃培养24 h，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽、直径5～7 mm的白色菌落（似蜡烛样颜色）。白色念珠菌则生长较慢，部分菌落48 h才肉眼可见，若平板上的微生物多，可能会造成菌落覆盖或重叠，虽逐日点计，但易被漏数，导致结果偏低。

综上所述，可以确定本次能力验证不满意结果的原因是原液或1∶10溶液菌落未长出或未被计数，未经过全面分析，照搬中国药典的菌落计数规则上报结果造成的。

3 纠正措施

当参加能力验证活动结果为不满意或可疑时，按照本院质量管理体系要求，应立即进行检验结果偏差（Out of Specification，OOS）分析，制定纠正与预防措施（Corrective Action and Protective Action，CAPA）[7-8]，并通过参加测量审核，再次进行考察直至取得满意结果。

（1）人员培训。对所有试验人员进行《中国药典》2020年版四部《1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》《中国药品检验标准操作规范》2019年版的培训，重新梳理知识体系，提高人员检验水平。

（2）检测检品。调取留样，特别是距离该试验最近一次验证的样品，重新对其进行回收试验，结果均在0.5～2.0之间，重新进行微生物限度检查，2次结果均一致，详见表3。

表3 能力验证前后同批次检品实验验结果对比

（3）实验室比对。从其他实验室调取样品进行比对试验，结果均一致。

（4）参加测量审核。立即报名参加药品中需氧菌总数测量审核，3批样品均得到满意结果。

4 监督、跟踪、恢复检验

纠正措施实施后，由质量监督员进行跟踪验证，确认各项纠正措施是否落实到位并按要求完成，检查实施情况是否有完整记录[8]。符合要求后，恢复检验工作，在下次的监督检查中还要进—步跟踪验证。严格审查纠正措施的可行性和有效性，对反复出现的问题加大审核的频次和力度[9]。

5 讨论

本次能力验证的组织方共制备了3种浓度6批样品，分别为能力验证样品A1、A2，B1、B2，C1、C2，合计制备样品总数为955瓶。样品A1、A2添加约105cfu的微生物，样品B1、B2添加约103～104cfu的微生物，样品C1、C2不添加微生物。组织方向每个实验室发放3份样品，为保证考核难度的均衡性，均包含1份样品C1或C2，剩余2份样品从样品A1、A2、B1、B2中随机抽取。

本次能力验证中，170家实验室的结果为满意，占比76.2%；10家实验室结果为可疑，占比4.5%；43家实验室结果为不满意，占比19.3%。经统计，A、B这2类样品中，有62份样品得到可疑或不满意的结果，其中B2样品的可疑或不满意率占比33.87%，C类样品未计入，结果见表4。可见B类样品的可疑或不满率大于A类样品。这可能与样品中微生物的数量有关，8月中下旬我国大部分地区高温高湿，微生物易受运输、温度等条件的影响。

表4 样品A1、A2、B1、B2（可疑+不满意）占比

能力验证是实验室质量控制的重要手段之一，是评价实验室技术能力的重要依据，实验室通过有目的、有计划地参加能力验证，可提高检验人员的检验能力。任何一个步骤出现问题都可能导致最终结果的偏离，因此验证结束后，组织方会提供详细的《能力验证结果报告》，对本次计划的关键技术要点进行详尽分析，能够促进检验水平的提升[10]。能力验证的结果若出现可疑或不满意，应当通过纠正与预防措施（CAPA）查找原因，并进行整改，以提升实验室的检验能力和管理水平。