蕲蛇实时荧光定量PCR快速鉴别方法的建立

裴社强 杨宝

（山西省检验检测中心药品检验技术研究所 山西 太原 030000）

1 前言

蕲蛇（Agkistrodon）为蝰科动物五步蛇的干燥体，多将其于夏、秋季捕捉，剖开蛇腹，除去内脏，洗净，用竹片撑开腹部，盘成圆盘状，干燥后拆除竹片，有祛风、通络、止痉的功效[1]，临床常用于风湿、肿瘤和心脑血管类疾病的治疗[2-5]。蕲蛇作为贵重的动物药材，临床功效确切，商品来源复杂，药材形态鉴别较为困难。近年来，由于野生资源逐渐匮乏，且价格昂贵，市场上出现蛇类伪品和混淆品甚多，且仅凭外部形态特征难以准确辨认[6]。从已报道的研究文献来看，蕲蛇的有效成分尚不明确，暂未发现蕲蛇的专属性检测化学成分，而传统的性状鉴别方法需要丰富的鉴别经验，由于蕲蛇本身价格昂贵，成方用量少，市售多为饮片产品，更增加了其鉴别难度。随着分子鉴定技术的引入，中国药典2010年版一部鉴别项下增加了蕲蛇的PCR鉴定，该方法用时较长，需要电泳检测，无法适应现场鉴定的需要[7]。

分子生物学能够从基因水平对蕲蛇成分进行鉴定，与传统检测方法相比，其具有特异性强、灵敏度高、可操作性强等特点，目前在中药材真伪鉴别领域已得到广泛应用。近年来，实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）技术的飞速发展，大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，使得成分含量的定量溯源成为可能[8]。本文基于蕲蛇CO1序列的特异性位点设计引物，同时结合药材快速提取技术[9]，引入TaqMan荧光探针，以期建立快速准确鉴别蕲蛇真伪的方法，为药材市场、生产企业、监管部门提供技术支持。

2 材料与方法

2.1 材料

高速冷冻离心机（Neofuge 13R，香港力康）；微量核酸分析仪（eppendorf）；荧光定量PCR仪（ABI 7500fast，美国热电）；梯度PCR仪（BIO-RAD C1000 TOUCH）；电泳仪（Power Pac Basic）；凝胶成像系统（美国伯乐）；TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（Tkara，Cat#9765）；Taq-ManTMFast Universal PCR Master Mix（2X）（ABI，NO.4366072）。引物、探针由上海生工生物公司合成。

本文共收集蕲蛇药材及其易混伪品14个物种25份样品，样品来源于广州清远、广西玉林、吉林通化、大连市药检所、桂林市药检所及太原市药店医院和生产企业等地，经山西省食品药品检验所主任药师罗晋萍鉴定，保存于太原市食品药品检验所，样品信息详见表1和表2。

表1 蕲蛇样品信息

表2 蕲蛇混伪品信息

（续表2）

2.2 仪器

万分之一分析天平（204，梅特勒公司）；纯水仪（Milli-Q，Millipore公司）；球磨仪（MM400，Retsch公司）；高速冷冻离心机（Neofuge 13R，香港力康公司）；微量核酸分析仪（eppendorf公司）；实时荧光定量PCR仪（MyGo Pro，IT-IS公司）。

2.3 试剂

聚乙烯吡咯烷酮40（PVP 40，上海远慕生物科技有限公司）；Triton X-100（上海生工生物技术有限公司）；定性滤纸（杭州双圈滤纸有限公司）；石蜡（莱卡公司）；扩增试剂TaqManTMFast Universal PCR预混液（2X，ABI，NO.4352042，赛默飞世尔科技中国有限公司）。引物由大连宝生生物有限公司合成，其他试剂为国产分析纯。

2.4 方法

2.4.1 样品DNA提取

为提高提取效率，本文采用杨璐等[9]开发的实验方法，具体如下：用剪刀将滤纸裁剪成44 mm×2 mm的长方形滤纸条，将其一端浸入加热融化的石蜡中；待晾干后形成40 mm×2 mm的疏水手柄区域，以便转移滤纸条，前端未浸渍石蜡的部分则为核酸结合区，用于后续的核酸吸附；为避免污染，用75%酒精棉球将样品表面擦拭干净，晾干，将干品用球磨仪粉碎成细粉状；称取经液氮研磨后新鲜或干燥药材粉末0.05～0.20 g，置于2 mL离心管中，研磨；加入500 μL裂解液，将样品裂解7 s；将滤纸圆盘浸入裂解液中3 s，以吸附核酸；将圆盘转移至1 750 μL清洗液中3 s，以清洗表面吸附的杂质；将圆盘转移至配制好的反应体系中。该方法与滤纸条法的不同之处，在于圆盘是保留在扩增体系中。

2.4.2 引物的设计与扩增

引物的设计：通过查阅文献和检索NCBI数据库，获得蕲蛇及其他常见近源物种序列，根据引物和Taq Man探针的设计原则，经过Oligov7.0.1设计出能够用于蕲蛇真伪鉴别的实时荧光PCR检测引物和探针，将设计的引物和探针序列在NCBI的Blast中进行搜索和比对，确定其特异性。

探针：5'FAM-TCCGGAGAGAGGTGGATAGAC GGT-TAMARA3'

上游引物：5'-ACTACTGCCCCCAGCATTACT-3'

下游引物：5'-CACTGATGGGCCGGAGTGTA-3'

扩增反应体系配制见表3。反应条件为：95℃预变性20 s，95℃变性3 s，60℃退火30 s，40个循环。

表3 反应体系配制表

2.4.3 特异性实验

特异性实验见表2，提取表2中样品的DNA作为模板。按照“2.4.2”中的反应体系和条件进行扩增，同时以灭菌双蒸水作为空白对照，验证引物和探针对蕲蛇样品扩增的特异性。

2.4.4 样品覆盖度实验

笔者携带快速检测仪器MyGo Pro实时荧光定量PCR仪及试剂，赴山西省国药集团进行快速检测，以表1中5批蕲蛇的DNA为模板，按照“2.4.2”中的反应体系和条件进行扩增，以灭菌双蒸水作为空白对照，进行覆盖度试验。

2.4.5 灵敏度实验

将50 ng的蕲蛇DNA模板用灭菌双蒸水10倍递减稀释，稀释浓度从高到低分别为：50、5、0.5、0.05、0.005 ng/μL，每个梯度进行5次平行实验，按照“2.4.2”中的反应体系和条件进行扩增，验证该方法的灵敏度。

3 结果与分析

3.1 特异性实验

如图1所示，空白对照无FAM荧光对数扩增曲线；非蕲蛇类样品无明显的FAM荧光对数扩增曲线，Ct值均＞40；阳性对照蕲蛇对照药材有FAM荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值＜35，证明实验有效。

图1蕲蛇特异性实验

3.2 样品覆盖度实验

图2 为笔者赴山西省国药集团进行5批蕲蛇样品快速检测的结果，经1 min快速提取，5批样品在40个循环中，均产生明显的荧光对数扩增曲线，Ct值均＜35，实验全过程不超过30 min，能够有效、准确地鉴别蕲蛇，经过专家鉴定和DNA条形码测序结果的比对，结果完全一致，证明该方法适用于市售蕲蛇的真伪鉴别。

图2 蕲蛇样品覆盖度实验

3.3 灵敏度实验

按“2.4.2”中方法进行PCR扩增，将所得Ct值进行线性拟合，得到标准曲线，如图3所示，曲线有明显的对数增长，相对标准偏差RSD均＜3.5%，扩增结果具有良好的重复性：y=-3.391x+18.862，R2=0.999，线性相关度良好。根据本标准曲线，计算得出，Ct值为35时，蕲蛇DNA的质量浓度为0.5 pg/μL，该实时荧光PCR体系的灵敏度为0.5 pg/反应。

图3 蕲蛇样品灵敏度扩增图谱

图4 蕲蛇样品灵敏度扩增标准曲线

4 讨论

目前，蕲蛇鉴别的经典方法为形态学[10]，当蕲蛇药材保存完整时，可通过其外观形态的典型特征进行鉴定，但是，若药材已被切成段状，通过性状就难以准确鉴别[11]。长期以来，研究人员普遍认为动物类中药的有效成分为其中的蛋白类成分，可通过胃肠道的消化吸收进入人体以发挥作用，但未见蕲蛇具有专属性特殊药理活性氨基酸类成分的报道[12]，故采用分子生物学检测具有极大优势。现行国家药品标准中国药典2010年增补版开始采用PCR检测方法鉴别蕲蛇真伪，但该方法为普通PCR法，需要电泳检测，检测耗时长，无法满足现场检测需求。

CO1是细胞色素氧化酶1基因的序列，其对动物鉴定的有效性已在多个类群中得到验证，成为动物条形码的核心序列[13]，故CO1分子标记被广泛应用于中药材的鉴定。本文依据中国药典2020年版四部[14]和陈士林[13]对中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，基于CO1分子标记，设计了特异性鉴别蕲蛇的引物和TaqMan探针，在40个循环内，蕲蛇对照药材（山西省国药集团样品）有荧光对数扩增曲线，其他非蕲蛇样品无荧光对数扩增曲线，与现行标准方法相比，本实验方法全程仅需20～40 min，而标准方法需要2 h以上；本实验方法使用仪器采集荧光判读结果，灵敏度更高，达到0.5 pg/反应，标准方法为普通PCR法，需要进行电泳实验；本实验方法全过程闭环操作，降低假阳性率，避免电泳时核酸染色剂对人员及环境造成危害；本实验方法操作较为简单，业务不熟练的人员也能够快速掌握，检测结果与形态学生药鉴定结果及DNA条形码测序结果完全吻合，具有极强的可靠性和稳定性。

5 结论

本文对市售蕲蛇样本进行荧光PCR检测分析，并进行特异性实验、灵敏度实验、样本覆盖度实验，结果表明，本文建立的引物和TaqMan探针使非蕲蛇类样品及阴性对照未产生费特异性扩增，有利于结果判读，可有效鉴别蕲蛇中药材真伪，全过程闭环操作，无需PCR后处理，实验结果由仪器显示，避免主观误差，本实验方法具有检测专属性强、准确率高、简单快速、无污染等优点，能够为蕲蛇真伪鉴别提供依据。