超高效液相色谱串联质谱法测定猪肝中克伦特罗的不确定度分析

2022-08-02陈旭晋苑华宁陆宇阳周锋杰曹佳

质量安全与检验检测 2022年3期

陈旭晋苑华宁陆宇阳周锋杰曹佳

（苏州市农产品质量安全监测中心江苏苏州 215000）

1 前言

克伦特罗属于β受体激动剂，是一种常见的肾上腺素类神经兴奋剂，将其加入饲料中，可以明显促进动物生长，改善肌肉和脂肪的分配比率，提高瘦肉率，因此被称为“瘦肉精”。其易在动物的腹膜组织中累积，人类摄入含β-受体激动剂的动物组织会引起急性中毒，因此我国农业部明令禁止在动物生产中使用。但在利益驱动下，仍有部分养殖业者违规使用，故相关检测监管工作具有重要意义。

不确定度是判断检测结果是否真实有效的一个重要参考指标，检测机构在出具报告时，应当附上不确定度分析，以体现其能力水平[1-2]。目前，对克伦特罗的检测主要采用液质联用法[3-4]。本文参考JJF 11 35-2005《化学分析测量不确定度评定》和JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》，对本实验室液质联用仪测定猪肝克伦特罗的不确定度进行分析，从而更准确地反映猪肝中克伦特罗的含量，以期为市场监管提供更可靠的数据。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸（色谱纯，美国霍尼韦尔公司）；盐酸克伦特罗对照品（纯度：99.4%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

2.2 仪器与设备

串联四极杆质谱系统（QTRAP 5500，美国AB SCIEX公司）；超高效液相色谱串联质谱仪（H_Class，美国Waters公司）；百分之一电子天平（BSA2202SCW，德国赛多利斯集团）；十万分之一电子天平（BT25S，德国赛多利斯集团）。

2.3 实验方法

2.3.1 标准溶液配置

精密称取盐酸克伦特罗对照品11.42 mg，置于100 mL容量瓶中；用甲醇溶解并稀释，即得浓度为100 μg/mL的标准储备液。

使用1 mL移液器量取100 μg/mL标准储备液1 mL，置于100 mL容量瓶中；用甲醇定容，即得1 μg/mL的标准中间液；量取1 mL标准中间液，置于100 mL容量瓶中，用0.1%甲酸溶液定容，即得10 ng/mL标准工作液。

2.3.2 样品前处理

参照农业部1025号公告-18-2008《动物源性食品β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法》4.4.1～4.4.4步骤进行操作。

2.3.3 测定条件

液相条件：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温：40℃；进样量：10 μL；流动相：流动相A：0.1%甲酸乙腈溶液；流动相B：0.1%甲酸水溶液。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子化电压：5 500 V；温度：550℃。

3 结果与分析

3.1 建立数学模型

猪肝中克伦特罗含量按式（1）计算：

式中，x——试样中克伦特罗残留量（μg/kg）；c——试样溶液中克伦特罗的浓度（ng/mL）；V——溶解残余物所用溶液体积（mL）；m——试料的质量（g）；f（rec）——校正因子。

3.2 不确定度来源

根据数学模型，影响猪肝中克伦特罗含量的不确定度的来源主要有：称量样品、配置标准储备液和工作液、配置校准曲线溶液、样品均一性引入的不确定度等。

3.3 各个不确定度分量评定

3.3.1 称量样品引入的不确定度Urel（m）

（1）重复称量样品所产生的误差：重复称样6次，称样量分别是2.01、2.01、2.01、2.00、2.00、2.01g，平均值为2.01 g，单次测量结果的标准不确定度以标准偏差表征，U（m1）=0.005 164 g。

（2）使用天平所产生的误差：查阅天平的检定证书可知，天平的测量不确定度为0.02 g（k=2）。试验中共使用天平2次，分别是天平去皮和猪肝样品称重，因此天平误差引起的不确定度0.014 1 g。故

3.3.2 标准储备液配置所产生的不确定度Urel（C）

（1）标准物质本身引起的不确定度：查阅标准物质的证书可知，其扩展不确定度为±0.2%（k=2），假设置信水平P=95%，则标准物质相对标准不确定度Urel（i）=0.001。

（2）固体标准品称量过程中产生的不确定度：查阅天平的检定证书可知，测量不确定度为0.03 mg（k=2），称样量为0.011 142 g，故称量过程中相对标准不确定度Urel（m3）=0.002 63。

（3）容量瓶定容产生的不确定度：查阅100 mL A级容量瓶检定证书可知，100 mL容量瓶引起的不确定度为0.018 mL（k=2），则U1（V1）=0.009 mL；实验室温度误差引起的不确定度，实验室温度为20±5℃，甲醇的温度膨胀系数为1.1×10-3，温度引起的不确定度为，用甲醇定容标准储备液的相对不确定度为Urel（V1）=0.003 18，配置标准储备液所产生的不确定度为Urel（C）=0.004 25。

3.3.3 标准工作液配置所产生的不确定度Urel（C-2）

标准工作液的配置过程引起的不确定度，主要来源于容量瓶定容和移液器移液所产生的不确定度。实验室温度为（20±5）℃，水的温度膨胀系数是2.1×10-4，温度引起的不确定度为U2（V2）=0.060 6 mL。故用0.1%甲酸水定容标准工作液的相对不确定度为Urel（V2）=0.000 632。查阅1 mL移液器检定证书可知，其扩展不确定度为0.54 μL（k=2），则U1（V1mL）=0.27 μL。由温度变化引起的不确定度为U2（V1mL）=0.003 18 mL，则Urel（V1mL）=0.003 19。已知，100 mL容量瓶引起的不确定度为U1（V1）=0.009 mL，用甲醇定容至100 mL的相对不确定度为Urel（V1）=0.003 18。则标准工作液配置过程所产生的不确定度为0.005 56

3.3.4 标准系列溶液所产生的不确定度Urel（std）

取匀浆后的空白样品2 g，置于50 mL离心管中，平行操作6次。分别向其中添加适量标准工作液，详见表1，按照“2.3”中的样品前处理步骤，得到空白添加标准系列溶液。

表1 克伦特罗标准系列溶液添加结果

由表1可知，100 μL移液枪的扩展不确定度为0.06 μL（k=2），则U1（V100μL）=0.03 μL；由温度变化引起的不确定度为U2（V100μL）=0.060 6 μL，则U（V100μL）使用2次，分别移取50 μL和100 μL，移取过程相互独立，故使用100 μL移液枪产生的相对标准不确定度

200 μL移液枪扩展不确定度为0.12 μL（k=2），则U1（V200μL）=0.06 μL；由温度变化引起的不确定度为U2（V200μL）=0.121 μL，则U（V200μL）=0.135 μL；使用1次，移取200 μL，故使用200 μL移液枪产生的相对标准不确定度Urel（V200μL）=0.000 675。

1 mL移液枪扩展不确定度为0.54 μL（k=2），则U1（V1mL）=0.27 μL；由温度变化引起的不确定度为U2（V1mL）=0.000 606 mL，则U（V1mL）=0.000 634；使用2次，分别移取0.5 mL和1.0 mL，且移取过程相互独立，故使用1 mL移液枪产生的相对标准不确定度Urel（V1mL）=0.001 42。

5 mL移液枪扩展不确定度为4 μL（k=2），则U1（V5mL）=2μL；由温度变化引起的不确定度为U2（V5mL）=0.003 03 mL，则U（V5mL）=0.003 63 mL；使用1次，移取2 mL，故使用5 mL移液枪产生的相对标准不确定度Urel（V5mL）=0.001 82。

则配置克伦特罗标准曲线溶液过程所产生的不确定度为Urel（std）=0.002 84。

3.3.5 样品均一性产生的不确定度Urel（uni）

对于实验过程中由样品均一性等引起的不确定度，本文通过6次平行实验测量结果的平均值的标准偏差来衡量，结果见表2，故

表2 样品6平行实验测定结果

3.3.6 实验过程中其他因素引起的不确定度Urel（rec）

本文以回收率的形式，评价检测过程中样品提取不充分、样品净化过程中存在损失或污染、仪器不稳定及其他随机因素引起的不确定度。通过基质添加浓度为2.00 μg/kg，平行4份样品进行添加回收实验，计算回收率。

结果显示，回收率分别为84.5%、88.0%、94.0%、93.0%。取矩形分布，按公式计算，则b+=94%-100%=-6%，b-=100%-84.5%=15.5%，故Urel（rec）=0.027 4。

3.4 不确定度分量的合成

将所有产生不确定度的分量进行合成，得到猪肝中克伦特罗含量的总合成相对标准不确定度Urel==0.032。则相对扩展不确定度（置信概率95%，k=2）为：Urel×k=0.032×2=0.064。猪肝中克伦特罗测定结果为2.04 μg/kg，因此测量结果的扩展不确定度为：U=0.064×2.04=0.13 μg/kg。

综上所述，猪肝中克伦特罗含量测定结果表示为：w=2.04±0.13 μg/kg（置信概率95%，k=2）。