乳粉中微生物检测的实验室间比对结果分析

林双庆 王仍瑞 许秋贝 郑小文 杨玉贞

（厦门海关技术中心 福建 厦门 361000）

1 前言

实验室间比对是指按照预先规定的条件，由多个实验室对相同或类似的样本进行检测的组织、实施和评价[1]，可作为能力验证的补充，强化实验室质量控制，是多种外部质量控制的方法之一。漳州市是福建省出口食品农产品的重要城市，2015年其食品农产品出口量居全国地级市首位[2]。本次实验室间比对评价了漳州地区以出口为主的63家食品企业的微生物检测能力，以帮助企业内部实验室查找日常检测工作中存在的问题，制定相应措施以保持或提升其微生物检测能力。本次实验室间比对共涉及6个微生物检测项目，2个定量项目包括菌落总数和大肠菌群，4个定性项目包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌。

2 材料与方法

2.1 主要仪器与试剂

恒温培养箱（F-0.5P，日本医化仪器公司）；全自动微生物鉴定仪（VITEK2 Compact 30，法国生物梅里埃公司）；生物安全柜（HF1200，上海力康生物医疗科技控股有限公司）；冷冻干燥机（LFD5508，韩国DAIHAN LABTECH公司）；高压灭菌锅（VB-95，德国SYSTEC公司）；TSA固体培养基、BHI液体培养基、BPW液体培养基，APW液体培养基（北京陆桥技术股份有限公司）；NaN3、海藻糖、谷氨酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；0.85%无菌生理盐水（实验室自制）。

2.2 标准菌株

鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）；金黄色葡萄球菌（ATCC6538）；表皮葡萄球菌（CMCC26069）；副溶血性弧菌（ATCC17802）；单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）；英诺克李斯特氏菌（ATCC33090）；大肠埃希氏菌（ATCC25922）；阴沟肠杆菌（CICC 21539）。菌株均来自专业机构保存的可溯源标准菌株。

2.3 方案设计

按参试实验室所报项目发放样品，定量项目随机发放1份考核样品，定性项目随机发送2份考核样品（阴性样本或阳性样本），每份样品对应1个唯一编号。参试实验室按《乳粉中微生物项目比对实验参试指导书》进行样品接收、检测和结果报送。方案同时赋予每个实验室1个代码，结果分析和能力评价均以实验室代码表示。

2.4 样品制备

将标准菌株在BHI液体培养基中复苏，增菌备用（副溶血性弧菌在APW液体培养基中复苏）；在含有保护剂的乳粉基质中添加预定浓度的目标菌悬液（部分项目添加背景干扰菌），充分混匀，装入西林瓶，冷冻干燥后完成制备。

菌株添加前需进行菌株纯度和关键生化特性验证；基质、保护剂和西林瓶等样品制备所需试剂耗材需经无菌处理，并在无菌环境中完成样品制备；致病菌样品在相应的生物安全等级区域完成制备。

2.5 检测方法

建议检测方法为GB4789系列国家食品安全标准[3-8]。

2.6 均匀性和稳定性检验

样品均匀性检验方法：样品分装后，随机抽取10份样品，每份样品重复测试2次，定性样品的测试结果均与样品指定值（阳性或阴性）一致时，说明该样品符合要求。定量样品依据CNAS-GL003：2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》中的单因子方差分析法（F检验法）进行均匀性检验[9]。

样品稳定性检验方法：（1）在贮存温度（4℃）下，于均匀性检验完成后的第10、20天，随机抽取3个样品进行检测；（2）在模拟样品的运输条件下（2天时间内样品可送达各实验室），将样品分别置于20℃、36℃和42℃环境条件下，于均匀性检验完成后的第3、6天，随机抽取3个样品检测。每个样品重复测试2次。定性样品的测试结果与样品指定值（阳性或阴性）均一致时，说明该样品符合要求。将定量样品的测试结果与均匀性检测数据进行比较，采用T检验法（依据CNAS-GL003：2018“5.2”中的内容）进行稳定性评价。均匀性和稳定性检验结果表明，样品之间不存在显著性差异，满足实验室间比对样品要求。

2.7 统计分析的设计和结果评价原则

定性项目：将参试实验室的检测结果与实验设计的指定值（阳性或阴性）进行比较，若两者结果一致，能力评价为“满意”；若结果不一致，能力评价为“不满意”。定量项目：参照CNAS-GL002《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》和CNAS-CL01-A001《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》的稳健统计方法，确定指定值X和能力评定标准差σ[10-11]，计算Z比分数（Z值），利用Z值进行结果评价。当｜Z｜≤2.0时，结果为“满意”；当2.0＜｜Z｜＜3.0时，结果为“可疑”；当｜Z｜≥3.0时，结果为“不满意”。

3 结果与分析

3.1 检测结果总体情况分析

本次实验共有65家实验室参与，收回368个实验结果。菌落总数项目共有63家实验室参加并报送结果，各反馈结果的实验室Z比分数见图1。统计数据表明，共有52家结果为“满意”，占比82.5%；5家结果为“可疑”，占比7.9%；6家结果为“不满意”，占比9.5%。

图1 菌落总数测定结果Z比分数分布柱状图

大肠菌群项目共有63家实验室参与，有5家结果无具体数值（大于或小于某个数值），未参与统计分析和结果评价，各反馈结果的实验室Z比分数见图2。统计数据表明，共43家结果为“满意”满意，占比74.1%；8家结果为“可疑”，占比13.8%；7家结果为“不满意”，占比12.1%。

图2 大肠菌群测定结果Z比分数分布柱状图

2个定量项目的检测结果见表1。

表1 2个定量项目结果满意的实验室家数及百分比

金黄色葡萄球菌项目共有43家实验室参与，收回86个结果，41家实验室结果为“满意”，占比95.3%；2家结果为“不满意”，占比4.7%。

沙门氏菌项目共有38家实验室参与，收回76个结果，37家实验室结果为“满意”，占比97.4%；1家结果为“不满意”，占比2.6%。

副溶血性弧菌项目共有22家实验室参与，收回44个结果；单核细胞增生李斯特氏菌项目共有18家实验室参与，收回36个结果，均未出现不满意结果。

4个定性项目检测结果见表2。

表2 4个定性项目结果满意的实验室家数及百分比

3.2 检测方法情况

除1家实验室的副溶血性弧菌项目采用SN/T 0173行业标准外，其他实验室和其他项目均使用GB 4789系列国家食品安全标准进行检测。

3.3 不满意结果分析

对本次实验反馈的结果进行分析，部分实验室出现可疑或不满意结果的原因可能为：

（1）样品处理不合理。未严格按照参试指导书制备样品，例如，未充分洗脱西林瓶内的样品或使其出现溢洒；分割一部分样品进行检测；样品溶解不充分，导致样品菌数发生变化。

（2）检验人员经验不足。有5家实验室未能给出大肠菌群MPN计数法检测结果的具体数值，说明其未能充分评估样品中的大肠菌群含量，未选择合适的稀释梯度进行实验。若实验过程中出现未对样品充分混匀、移液器使用不规范、培养基温度过高等情况，也会影响检测结果。

（3）检测方法使用不当。部分实验室未能使用现行有效标准，如代码P7实验室采用已废止的标准GB 4789.2-2010和GB 4789.3-2010，代码P11实验室采用的SN/T 0173-2010由SN/T 0173-2018替代[12]。

（4）出现假阴性结果可能原因：培养基质量不能满足实验要求，未分离出典型菌落；进行生化实验时，未使用标准菌株作阴阳性对照；仅挑取1～2个可疑菌落进行生化实验，结果为假阴性时直接判定结果。

（5）出现假阳性结果可能原因：在同时检测2份样品的过程中，发生了交叉污染，阴性样品受阳性样品污染，出现假阳性结果；培养基出现典型或可疑菌落后，未按要求进行生化和血清验证就判定为阳性结果。

4 讨论

本次实验室间比对实验定量项目结果的满意率较低，菌落总数为82.5%，大肠菌群为74.1%；定性项目结果的满意率较高，4个项目均达到90%以上。影响检测结果准确性的因素有检测人员、仪器设备、样品处理、标准物质、检测方法、设施与环境条件、试剂材料等[13]，在检测过程中应对这些因素进行合理有效的控制。结果为“不满意”的实验室应当增加相关项目的外部质控活动频次，及时发现不足和积累经验，不断提升自身检测业务能力，有效控制食品安全风险，确保检测质量符合国家标准要求。