UPLC同时测定小儿柴桂退热颗粒中的12种成分

朱泽兵 袁林 张德伟

（重庆市万州食品药品检验所/三峡库区道地药材开发利用重庆市重点实验室 重庆 404000）

1 前言

小儿柴桂退热颗粒由柴胡、桂枝、葛根、黄芩、白芍等7味药材组成，收载于《中国药典》2020年版一部，具有发汗解表、清里退热的功效，常用于治疗小儿外感发热[1]，或与其他药品联用治疗小儿呼吸系统疾病[2-4]。现有质量标准仅对葛根中的葛根素进行定量分析，其余成分均采用薄层色谱进行定性鉴别，不利于其质量控制。刘昌孝院士[5-10]提出中药质量标志物（Q-marker）概念，指出客观评价中成药的质量是非常重要的[11-17]，当前，相关研究大多采用一侧多评、指纹图谱、特征图谱、液相色谱质谱联用仪等测定中成药的成分[18-20]。本文采用超高效液相色谱法多波长同时测定样品中多组分技术，测定小儿柴桂退热颗粒12中成分的含量，以期为相关人员提供参考。

2 仪器与材料

2.1 仪器

超高液相色谱仪（LC-30A，配二极管阵列检测器（RF-20AXS），日本岛津公司）；Accucore aQ C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，2.6 μm）；十万分之一天平，万分之一天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）；超纯水机（重庆市科润水处理设备有限公司）。

2.2 试药

小儿柴桂退热颗粒（批号：20201177、20191012，贵州百灵企业集团制药股份有限公司）（批号：20210105，葵花药业集团（襄阳）隆中有限公司）；桂皮醛（批号：110710-2019022，含量：99.5%）；葛根素（批号：110752-201916，含量95.4%）；黄芩苷（批号：110715-201921，含量95.4%）；芍药苷（批号：110736-201935）；汉黄芩素（批号：111514-201812，含量100.0%）；汉黄芩苷（批号：112002-201802，含量98.5%）；黄芩素（批号：111595-202108，含量97.9%）；大豆素（批号：100398-201501，含量96.2%）；大豆苷（批号：111738-202004，含量93.4%）；柴胡皂苷a（批号：110777-202012，含量94.8%）；柴胡皂苷d（批号：110778-202112，含量96.3%含量）（中国食品药品检定研究院）；葛根素-7-木糖苷（批号：BWB51132，含量91.7%，来源北京北納创联生物技术研究院）；乙腈（色谱纯，美国默克公司）；乙酸铵（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，成都科隆化学品有限公司）；其余试剂为分析纯。

3 方法与结果

3.1 UPLC检测条件

流动相：乙腈为流动相A，水（含5mmoL/L乙酸铵）为流动相B；梯度洗脱：0～5 min，8%A；5～10 min，8%→20%A；10～20 min，20%→35%A；20～25 min，35%→58%A；25～30 min，8%A；流速：0.3 mL/min；进样量：2μL；柱温：30℃。

检测波长：桂皮醛、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷、黄芩素（280 nm）；芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d（210 nm）；葛根素、大豆素、大豆苷、葛根素-7-木糖苷（250 nm）。

3.2 溶液制备

3.2.1 供试品溶液制备

取本品适量，研细；精密称取2 g，置于具塞锥形瓶中；加入70%乙醇100 mL，称定重量；超声提取30 min，再次称定重量；用70%乙醇补足减失的重量，滤过；精密量取1 mL，置于100 mL量瓶中；加入70%乙醇至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜，即得。

3.2.2 混合对照品溶液制备

精密称取桂皮醛、葛根素、黄芩苷、芍药苷、汉黄芩素、汉黄芩苷、黄芩素、大豆素、大豆苷、葛根素-7-木糖苷、柴胡皂苷a与柴胡皂苷d对照品适量，置于量瓶中；加入70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

阴性样品溶液：按处方比例及制备工艺，分别制备缺桂枝、柴胡、葛根、黄芩、白芍药材的阴性模拟制剂，同时按“3.2.1”项的制备方法制成阴性样品溶液。

3.3 专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、空白溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各5 μL，按“3.2.1”项的条件进行测定，结果见图1，可见阴性样品溶液无相应的色谱峰出现。

图1 12种成分液相色谱图

3.4 检出限和定量限

精密量取“3.2.2”项的混合对照品溶液，用70%乙醇不断稀释已知浓度的对照品溶液，按“3.2.1”项的条件进样分析，记录色谱图，以信噪比为3∶1和10∶1，分别计算检出限和定量限，结果见表1。

3.5 线性关系的考察

用70%乙醇将对照品储备液逐级稀释，配制成不同浓度的混合对照品工作溶液，在按“3.2.1”项的条件进样分析，记录色谱图，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。结果表明，12种成分在相应的质量浓度范围内，其线性关系符合要求，详见表1。

表1 各成分线性关系、检出限和定量限

3.6 精密度试验

取批号为20210105的样品，按“3.2.1”项的方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。结果显示，各成分峰面积RSD为0.59%～2.06%，均＜3%，表明该方法的精密度符合要求，详见表2。

3.7 稳定性试验

取批号为20210105的样品，按“3.2.1”项的方法制备供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24 h，按“3.1”项的条件进行测定，记录色谱图。结果显示，各成分峰面积RSD为0.73%～2.19%，均＜3%，表明供试品溶液在24 h内稳定，详见表2。

3.8 重复性试验

取批号为20210105的样品，按“3.2.1”项的方法制备供试品溶液6份，按“3.1”项的条件测定，记录色谱图。结果显示，各成分峰面积RSD为0.58%～1.75%，均＜3%，表明本方法的重复性符合要求，详见表2。

3.9 加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：20210105），研细，取约1 g，精密称定6份，置于具塞锥形瓶中，分别加入对照品储备溶液适量，按“3.2.1”项的方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果显示，12种成分的加样回收率为94.86%～104.91%，RSD值为1.29%～2.94%，详见表2。

表2 12种成分方法学结果（n=6）

3.10 样品含量测定

本文选取3批样品，每批精密称取2 g，平行2份，按“3.2.1”制备方法制成供试品溶液，进行测定，计算12种成分的含量，结果见表3。

表3 12种成分含量（n=2，mg/g）

4 讨论

4.1 提取方法的考察

本文参照《中国药典》2020年版一部中小儿柴桂退热颗粒“含量测定”中的条件[1]，对不同提取溶剂进行比较，如甲醇、0.1%甲酸的甲醇溶液、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、0.1%甲酸的乙醇溶液；对不同超声时间进行比较，如15、30、60、90 min。实验结果表明，不同提取溶剂和时间对各成分的含量影响非常大，最终确定“3.2.1”项的供试品溶液制备方法为最优方法。

4.2 色谱条件的考察

本文考察了甲醇—乙酸水溶液、甲醇—乙酸铵水溶液，乙腈—乙酸铵水溶液，乙腈—乙酸铵水溶液体系，加梯度洗脱更有利于多种成分的分离，且各成分的灵敏度也能达到检测的要求，最终确定了“3.1”项的色谱条件为最优方法。

4.3 检测波长选择

桂皮醛的最大吸收波长为290 nm；黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷、黄芩素的最大吸收波长为280 nm；芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的最大吸收波长为210 nm；葛根素、大豆素、大豆苷、葛根素-7-木糖苷的最大吸收波长为250 nm，故对这12种成分不能以单一波长进行紫外检测。使用二极管阵列检测器（RF-20A），在203 nm～800 nm进行全扫描发现，桂皮醛在280 nm也有较强吸收，故本文选取3个波长进行检测。实验结果表明，该方法快速高效、灵敏度高、专属性好，可用于小儿柴桂退热颗粒中多成分含量的测定。